基于實時熒光定量監測逆轉錄病毒MuLV/Friend感染方法的建立與評價

宋姝庭，孫 麗，蔣金鳳，黃 海，王建華

(1. 上海大學生命科學學院，上海 200444；2. 中國科學院上海巴斯德研究所，上海 200031)

MuLV/Friend感染小鼠模型的建立，在研究逆轉錄病毒致病機制、抗病毒策略評價，以及腫瘤的發生中具有重要的意義。MuLV/Friend感染急性階段，血液中病毒載量快速上升，引發機體免疫反應以抑制病毒復制，隨后，感染進入慢性階段，在此過程中，病毒整合到宿主基因組中[7]。由于MuLV/Friend與人類免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)病毒復制特性及急性臨床癥狀相似，MuLV/Friend感染的小鼠艾滋病模型被用來研究機體抗逆轉錄病毒免疫機制，以及用于體內評價抗HIV-1藥物的安全性和有效性[8]，且因為MuLV/Friend在慢性感染階段會誘發腫瘤，這一模型也被廣泛地應用到探討腫瘤發生、發展機制及評價治療策略等方面[4,9-10]。

目前，對于檢測病毒的復制主要采用計算病毒感染導致的脾腫大指數(splenic index,SI)的方法[11]，該方法不能實時、精確地定量病毒復制及在其它組織中的分布。本研究中，我們建立了一種基于實時熒光定量(qRT)-PCR[12]的病毒復制檢測方法，可用于實時定量小鼠各組織內病毒載量，為利用MuLV/Friend小鼠感染模型研究抗逆轉錄病毒策略或宿主免疫等，提供一種特異、快速、靈敏的監測病毒復制的手段。

1 材料與方法

1.1實驗動物MuLV/Friend病毒感染6～8周齡♀ BALB/c小鼠，購自上海靈暢生物科技有限公司，動物合格證號為：SCXK(滬)2013-0018。實驗獲得中國科學院上海巴斯德研究所動物倫理批件(IPS動倫審第2013014號)。

1.2試劑與儀器戊巴比妥鈉(上海隆盛公司)；TRIzol試劑(Life Technologies公司)；三氯甲烷、異丙醇(上海滬試公司)；RNA逆轉錄試劑盒(TOYOBO公司)；DNA聚合酶(Vazyme公司)；T4 DNA連接酶(NEB公司)；PMD-19T載體(TaKaRa公司)；快速質粒小提試劑盒(TIANGEN公司)；qRT-PCR TaqMan試劑盒(康為世紀公司)。Prism7900實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3qRT-PCR定量標準品的構建MuLV/Friend病毒株由廣州中醫藥大學符林春教授惠贈。TRIzol試劑提取病毒基因組RNA，利用RNA逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA；擴增病毒gag區域，連入PMD-19T載體，構建標準品質粒；利用Nanodrop測量質粒濃度，并根據標準品質粒分子量，計算質粒拷貝數。擴增gag使用上游引物序列為5′-CTCTTTCTCCGAGGACCCAG-3′，下游引物序列為5′-GTCATTGGGCAGCTGAGTTG-3′，合成特異性熒光探針，探針序列為5-Carboxyfluorescein(5-FAM)-ACAGCTTTGATCGAGTCCGTTCTCCT-Carboxytetramethylrhodamine(TAMRA-3)。gag擴增條件為：95℃，10 min，預變性；95℃，15 s，變性；60℃，1 min，退火/延伸，40個循環。

1.4BALB/c小鼠感染、組織RNA的抽取及病毒載量檢測6～8周齡BALB/c小鼠飼養于SPF級動物房。BALB/c小鼠腹腔接種MuLV/Friend;感染2、4、5、7、10、12、16、20、28 d后，戊巴比妥鈉安樂死，小鼠解剖后獲取各組織。將組織充分研磨，50 mg組織加入1 mL TRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置10 min，待組織充分裂解；加入200 μL三氯甲烷，搖晃15 s，室溫靜置10 min，液體分層； 4℃、12 000×g離心10 min；將上清轉入新的EP管中，加入500 μL異丙醇，上下顛倒6～8次，室溫靜置10 min；4℃、12 000×g離心10 min，棄上清，加1 mL 4℃預冷的75%乙醇；4℃、12 000×g離心5 min，棄上清，待沉淀干燥后，加入適量DEPC水溶解抽提的RNA，并利用Nanodrop測量RNA濃度。利用上述條件，qRT-PCR擴增病毒gag區域，參考標準曲線，定量各組織內病毒載量。

2 結果

2.1qRT-PCR定量標準品的構建利用DNA聚合酶試劑盒擴增病毒gag區域，連入PMD-19T載體，構建標準品質粒；Nanodrop測量質粒濃度，根據標準品質粒分子量，計算出質粒拷貝數,標準品質粒進行10倍比稀釋，共7個濃度梯度(Tab 1)。在擴增反應中，qRT-PCR儀檢測gag區域探針熒光信號，并獲得各濃度標準品的Ct值(Tab 1)，該Ct值與各濃度標準品拷貝數的Log值可構建標準曲線(Fig 1A)，能夠對MuLV/Friend病毒進行定量。核酸電泳驗證目的擴增條帶的分子量(Fig 1B)；以水為模板作陰性對照，擴增所得Ct值為34.3，高于稀釋10-10倍的標準品Ct值，因此，利用該建立的qRT-PCR方法，最低可以監測到10-9倍稀釋的標準品，其對應的MuLV/Friend拷貝數為1.54×105copies·L-1。該檢測方法具有較高的靈敏度。

Tab 1 Serial dilution of MuLV/Friend gag standard substanceand summary of Ct values from real-time quantitative RT-PCR

2.2急性感染階段各組織中病毒分布監測為分析急性感染階段MuLV/Friend在各組織器官內的分布情況，BALB/c小鼠腹腔接種1×109拷貝數的病毒，感染14 d后，戊巴比妥鈉安樂死，解剖后取小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸道、胸腺、腦、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、腸系膜淋巴結、payers’淋巴結、血清和白細胞，利用建立的qRT-PCR法，檢測各組織器官中gag區域的Ct值，并將所得Ct值引入標準曲線公式，計算可得各組織器官中的病毒載量拷貝數。感染14 d，發現明顯的脾腫大(Fig 2A)，并發現心、肝、脾、肺、腎、腸道、胸腺、腦、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、腸系膜淋巴結、payers’淋巴結、血清和白細胞中，均有不同程度的病毒復制，而血液和脾臟中病毒載量高于其他組織(Fig 2B)。結果表明，感染后14 d，病毒已建立了系統感染，且病毒在血液和脾臟中復制較高。

Fig 1 Establishment of standard curve for real-timequantitative reverse transcription PCR assay

2.3急性感染階段血液和脾臟中病毒復制的動態監測為進一步監測MuLV/Friend急性感染期病毒復制動力學，我們分析了急性階段脾臟和血液中病毒載量的動態變化。BALB/c小鼠腹腔接種1×109拷貝數的病毒，分別感染2、4、5、7、10、12、16、20、28 d，每組3只小鼠，戊巴比妥鈉安樂死，解剖后取小鼠的血液和脾臟，利用qRT-PCR檢測法檢測血液和脾臟中的gag區域的Ct值，并將所得Ct值引入標準曲線公式，計算后得血液和脾臟中MuLV/Friend的拷貝數(Fig 3)。結果表明，在感染10 d時，病毒載量達到了頂峰，隨即下降。

Fig 2 Viral distribution in tissues(n=8)

BALB/c mice were infected via i.p. with MuLV/Friend for 14 d,and the splenomegaly was observed (A). a:mock (PBS) infection;b:virus infection. Viral loads in multiple tissues were quantified (B).

Fig 3 Dynamic kinetics of virus replication

Viral loads in blood and spleen were quantified at the indicated time of post-infection.

3 討論

MuLV/Friend是一種逆轉錄病毒，能引起小鼠紅白細胞血癥，其發病過程與HIV-1引起的人類免疫缺陷綜合癥相似，常用于感染小鼠建立小鼠艾滋病模型，研究宿主抗病毒反應和評價抗病毒策略[9]。感染初期，MuLV/Friend能促使紅系祖細胞在不依賴紅細胞生長素情況下在脾臟中大量分化，形成紅細胞，導致脾臟腫大[5-6,13]。感染后期，會使原癌基因和抑癌基因發生突變，誘發腫瘤[11]。傳統方法主要通過計算脾腫大指數檢測病毒復制，但敏感度不夠高，結果不夠精確，需要建立一種靈敏度更高，且操作簡便的方法檢測MuLV/Friend 的感染復制。因此，我們構建了基于qRT-PCR的方法，可用于實時監測MuLV/Friend的復制。本研究通過構建MuLV/Friend病毒標準品，并設計病毒gag區域特異性探針，利用qRT-PCR，最低可監測到1.54×105copies·L-1的MuLV/Friend 病毒，相較于過去計算病毒導致脾腫大指數的方法，更為直接和精確，操作也相對簡便，為定量分析MuLV/Friend復制提供了有效手段。利用該方法檢測感染后d 14各組織器官的病毒載量，發現脾臟和血液中的病毒載量高于其他組織，說明脾臟和血液是MuLV/Friend主要復制位點，提示在分析MuLV/Friend急性感染動力學中，應更多關注脾臟和血液中的病毒復制狀況。監測MuLV/Friend急性感染期脾臟和血液中的病毒復制動態曲線，發現病毒載量在感染d 10最高，隨后下降,這與之前文獻報道相一致[7,14]，也說明了該方法的可靠性。

借助MuLV/Friend感染小鼠模型，可研究逆轉錄病毒感染初期宿主免疫反應。利用該模型已分析了 CD4+、CD8+T細胞及B淋巴細胞在感染中的作用，如CD4+和CD8+T淋巴細胞產生IFN-γ可以抑制病毒復制；CD4+輔助型T細胞和濾泡輔助型T細胞可以增加細胞毒性淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)反應，促使B細胞產生中和性抗體[7-8,15]。利用MuLV/Friend感染小鼠模型分析逆轉錄病毒急性感染階段的宿主免疫反應，與猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)感染非人靈長類模型以及病人取材相比，更具有可控性、方便性，因此，這一模型在逆轉錄病毒感染研究中具有重要的應用意義。

(致謝：感謝廣州中醫藥大學符林春教授惠贈MuLV/Friend病毒株。)