圓齒野鴉椿朔果著色及呈色分析

袁雪艷，鄒小興，黃 維，張曉華，陳澤明，孫維紅，李艷蕾，陳路瑤，鄒雙全

（福建農林大學林學院自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

圓齒野鴉椿Euscaphis konishii Hayata為省沽油科Staphyleaceae野鴉椿屬Euscaphis植物，是賞藥兩用的優良鄉土樹種。傳統及現代醫學研究表明，圓齒野鴉椿果實有很好的抗癌及抗炎癥等作用，其根、花、干果均可入藥[1]。而且近年來，圓齒野鴉椿開始用作觀賞植物[2-3]， 最突出的觀賞部位是果實，其掛果期長達6個月，滿樹的紅果橫跨秋冬季節，可為秋冬季節增添許多喜慶的色彩，被認為是極具開發潛力的秋冬季觀果樹種。目前，有關圓齒野鴉椿的相關研究僅集中在繁殖技術[4]、化學成分研究[5]和藥理研究[6]等方面，而有關果實著色機制的研究未見報道。

在果實發育過程中，果實的呈色與葉綠素（Chlorophyll）、類胡蘿卜素（Carotenoid）和類黃酮（Flavonoid）的種類和含量比例有關[7]。通常，果實在幼果時為綠色，成熟后則呈現多彩的顏色，這是因為隨著果實的成熟，果實細胞中的葉綠素不斷降解，黃色、橙色果實中的類胡蘿卜素和紫色、紅色果實中的花青素（Anthocyanin）（屬于類黃酮物質）的不斷積累的結果[8]。果色是影響經濟果品經濟價值的重要因素之一，在各類果樹中已引起廣泛關注，如獼猴桃[9]、柑橘[10]和荔枝[11]等，同時果色作為園林觀果樹種最重要的觀賞性狀之一，果實變色機理已在秋海棠[12]、南天竹[13]等觀果植物進行過研究，但圓齒野鴉椿作為極具觀賞價值的觀果樹種，其朔果發育過程中果實生長發育和色澤變化方面的變化機理未見報道。現今，廣泛應用的園林觀賞植物均具多元化的觀賞性，單一的葉色、花色、果色等已不能滿足人們的觀賞需求，于是利用分子手段人工調控觀賞性狀逐漸成為園林觀賞植物的研究趨勢。因此，本文研究圓齒野鴉椿朔果7個時期的色素和色澤變化，以探討其果實色素與呈色的變化規律，為深入研究圓齒野鴉椿果實顏色調控機制、選育圓齒野鴉椿新品種提供理論依據及技術支持，也為利用分子生物手段改良品種提供生理學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在福建清流靈地鎮選擇3株生長基本一致且集中生長的圓齒野鴉椿作為試驗樣株，圓齒野鴉椿果實采樣于6月末—11月初進行，共采集7個階段（盛花期后50、70、100、115、130、160、180 d）圓齒野鴉椿果實,見圖1。將一部分圓齒野鴉椿的果皮和種子進行分離，一部分用錫紙包住，凍存于干冰中，運回實驗室后馬上用液氮速凍存放于-80 ℃冰箱備用。一部分用60 ℃鼓風干燥箱烘干至恒質量，并稱取干質量，另外再摘取新鮮的果實存于裝有冰袋的冰盒中，運回實驗室后馬上用相機拍攝整體果實外觀、內果皮和外果皮。

1.2 試驗方法

1.2.1 果實顏色數字化描述

在晴天光線充足的環境下用同一相機拍攝。相機機身為Nikon/尼康 D 810，鏡頭Nikon 7 mm F 2.8微距鏡頭。相機設置：光圈優先，鏡頭光圈F8，白平衡設置為日光模式。背景紙選用白色A4紙。顏色數字化描述參照李欣等[14]的方法。打開Photoshop 圖像處理軟件，選取CMYK 模式命令，添加試材圖像到選區，選取果實兩側的中間部位，從頂端到果梗的前端進行切割，切割的果長乘以黃金分割點0.618（從頂端開始算起），得到待測區域，再用吸管吸取外果皮、內果皮和種皮典型色域的顏色，得出C（青色）、M（洋紅色）、Y（黃色）、K（黑色） 的百分比值。

1.2.2 果實色素的初步分析

1.2.2.1 色素類型的定性分析

取不同發育時期的果實，經液氮研磨后各取0.1 g于10 mL離心管中，分別加入石油醚、10%鹽酸溶液、30%氨水5 mL，觀察顏色變化并進行記錄。

1.2.2.2 類黃酮的顯色反應

測定方法參照智雅靜等[15]的方法，取不同烘干果皮粉末各0.1±0.005 g，分別用鹽酸（HCl）化甲醇（MeOH）溶液（HCl與MeOH體積比為1∶99） 提取15 h，過濾，定容至25 mL，各取2 mL提取液，進行以下9種顯色反應：濃鹽酸-鋅粉反應；濃鹽酸-鎂粉反應；三氯化鐵反應；三氯化鋁反應；氨性氯化鍶反應；硼酸反應；濃硫酸反應；堿性試劑反應；硼氫化鈉反應。

1.2.3 果皮色素的定量分析

參照高俊鳳的方法[16]測定葉綠素和類胡蘿卜素的含量；采用熱浸提法測定圓齒野鴉椿果實的類黃酮含量，具體方法參照吳清韓等[17]的方法；采用超聲輔助的pH示差法測定圓齒野鴉椿果實的花青素，具體方法參照楊敏等[18]和吳春太等[19]的方法。

2 結果分析

2.1 果色的數據化描述

隨著果實的成熟，外果皮的C、M、Y、K值變化差異顯著，見圖1、圖2。由圖1、圖2可知，K值始終保持低值，在盛花期后50～70 d的C、M、Y值大小依次為：Y＞C＞M，在70 d之后則呈現Y≥M＞C，說明在外果皮綠色期C、Y值對色彩的變化起決定作用，而外果皮從紅綠相間到全紅，是M、Y值起決定作用。

在果實發育過程中，內果皮的C、M、Y、K值的變化呈現出一定的規律，在7個發育階段中K值均接近0，而Y值基本處于高值。隨著果實的成熟，C值呈逐漸下降的趨勢，在盛花期后70 d就低于M值，而M值則逐漸升高，并在盛花期100 d超過Y值，之后均保持高值。即，在盛花期后50 d時，C、Y是內果皮呈現嫩綠色的主要原因，在盛花期后70～180 d內果皮由粉綠相間逐漸變成全紅，是由M、Y值起決定作用，見圖1、圖2。

圓齒野鴉椿種皮顏色的變化是觀測果實成熟的重要指標。在盛花期50 d，其種皮為乳白色，C、M、K、Y均為最小值；盛花期后70 d，種皮為棕色，其K值接近0，C值略大于50 d，而M、Y值則呈現激增的現象，說明種皮棕色與M、Y值關系密切；盛花期后100～115 d，屬于棕黑相間的時期，期間C、K值逐漸升高，Y值逐漸下降，而M值則先降后升；盛花期115～180 d，屬于C、K值先急劇增大后趨于平穩，且C、M、Y、K值相互間逐漸接近，說明C、K值對種皮顏色加黑有決定性作用，見圖1、圖2。

圖1 圓齒野鴉椿果實顏色變化Fig. 1 The color change of Euscaphis konishii Hayata fruit

圖2 外果皮(ex)、內果皮(en)和種皮(sc)顏色測定結果Fig. 2 The results of exocarp, endocarp and seed coat color

2.2 果實色素類型的特征顏色反應

在石油醚反應中，若提取液出現黃色，說明果皮中可能含有類胡蘿卜素。本試驗中，7個發育時期的圓齒野鴉椿果皮的石油醚顯色反應都出現無色，說明類胡蘿卜素含量極低或者不含類胡蘿卜素。

在10%的鹽酸測試中，若提取液呈現紅色，則說明果皮中可能含有花青素。本試驗中，提取液出現無色、粉色、紅色3類顏色。其中，盛花期后50～70 d為無色，說明不含花青素或花青素含量極低；盛花期后100～115 d出現淡粉色和粉色，說明花青素含量較低；盛花期后130～180 d表現為淡紅色和紅色，說明花青素含量較高。

在30%氨水測試中，7個不同發育期的圓齒野鴉椿提取液表現出不同程度的黃色。盛花期50、130 d出現深黃色，表明果皮中可能含有黃酮醇類化合物；盛花期后70、100、115、160 d呈現黃色，表明果皮中可能含有黃酮色素。見表1。

表1 圓齒野鴉椿果皮色素類型測試的顏色反應?Table 1 Color reaction of pigments of Euscaphis konishii Hayata

2.3 類黃酮的定性測試

（1）濃鹽酸-鋅粉反應：由表2可知，盛花期后50～100 d出現不同程度的黃色，表明這3個時期的圓齒野鴉椿果皮可能含有黃酮，而盛花期后115～180 d呈現不同程度的粉色和紅色，表明可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮或花青素類化合物，說明果實發育過程中會產生新的黃酮類化合物。

（2）濃鹽酸-鎂粉反應：盛花期后50～70 d出現綠色和黃色，而100～180 d出現不同程度的粉色和紅色，說明在100 d之后可能合成了黃酮、黃酮醇、二氫黃酮或花青素類化合物。

（3）FeCl3反應：由表2可知，不同發育時期的圓齒野鴉椿果實浸提液與FeCl3反應均出現深褐色，說明7個發育時期的果皮均不含酚羥基。

（4）AlCl3反應：盛花期后50、70 d出現不同程度的黃色，說明可能含有黃酮。

（5）氨性氯化鍶反應：不同發育時期的果皮均出現沉淀，說明含有鄰二酚羥基結構的黃酮類化合物。

（6）硼酸反應：不同發育期的果皮不同程度的綠色、粉色及紅色，說明不含C5-OH結構。

（7）濃硫酸反應：不同發育時期的果皮浸提液均出現紅褐色，可能含有花青素。

（8）堿性試劑：盛花期后50、130 d出現顏色較深的黃褐色，相比之下，其余的5個發育時期則出現顏色較淺的黃色，說明前者可能含有的二氫黃酮或二氫黃酮醇大于后者。

（9）硼氫化鈉反應：盛花期后50～70 d出現綠色和黃色。100～180 d出現不同程度的粉色和紅色，說明100 d之后可能產生了二氫黃酮。

表2 圓齒野鴉椿果皮類黃酮的顯色反應Table 2 Color reaction of flavonoids in different Euscaphis konishii Hayata

2.4 果皮色素成分的紫外可見光譜分析

利用可見紫外分光光度計在400～700 nm范圍內全波段掃描葉綠素和類胡蘿卜素提取液，葉綠素的特征吸收峰出現在665 nm附近，類胡蘿卜素大約在435、470 nm有吸收峰；類黃酮在500 nm左右出現峰值，且無雜峰干擾，在500 nm處，測定標準樣品的吸光值，并以吸光值為縱坐標，質量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線。得到回歸方程為：y＝4.917 2x＋0.005 1，R2＝0.999 1，表明蘆丁質量濃度在0.013 8～0.082 8 mg/mL范圍內線性關系良好；花青素在520 nm左右出現峰值，且無雜峰干擾。

圖3 葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮和花青素光譜掃描圖Fig. 3 UV-Vis absorption spectrum of chlorophyl, carotenoid, flavonoid and anthocyanin

2.5 果皮色素含量分析

在圓齒野鴉椿果實發育過程中，葉綠素呈現先急劇下降到緩慢下降的趨勢。盛花期后50 d葉綠素含量最高，其含量高達0.303 mg·g-1，在盛花期30～115 d葉綠素含量急劇下降，之后下降趨勢減緩，并在180 d達到最小，見圖4A。

由圖4B可知，在不同的發育階段，圓齒野鴉椿類胡蘿卜素含量分布在0.016～0.050 mg·g-1之間，含量均較低，隨著果實的成熟，類胡蘿卜素基本呈現不斷下降的趨勢。類胡蘿卜素與葉綠素之間呈顯著正相關（R＝0.991）（表3），說明在合成代謝過程中二者可能有良好的協同作用。

在果實發育過程中，類黃酮含量出現先下降后上升再下降的S型變化趨勢，見圖4C。由圖4C可知，類黃酮最高出現在盛花期后50 d，含量高達28.378 mg·g-1，之后出現劇降，直到盛花期后100 d才又開始逐漸上升，并在盛花期后130 d出現第二個峰值25.326 mg·g-1，之后開始逐漸下降至盛花期180 d出現最低值20.975 mg·g-1。類黃酮與葉綠素和類胡蘿卜素均呈顯著正相關，而與花青素相關性不顯著，見表3。

圖4 果實主要色素的變化Fig. 4 The changes of fruit pigments

圖4D表明，隨著野鴉椿果實的不斷成熟，花青素的積累量不斷增加。其中，在盛花期后50～70 d，花青素含量緩慢增加，在盛花期后70～180 d，花青素含量處于激增狀態，并在180 d達到最高值3.880 mg·g-1。花青素與葉綠素和類胡蘿卜素均呈顯著負相關（表3），說明果實呈色過程中，葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸減少，伴隨著花青素的增加。

2.6 果實色澤與色素含量的關系

在CMYK模式中，C、M值分別代表青色和洋紅，測得圓齒野鴉椿果皮的葉綠素和類胡蘿卜素含量與內外果皮的C值呈顯著正相關，而與M值呈顯著負相關，說明圓齒野鴉椿從綠色變為紅色，可能與葉綠素和類胡蘿卜素的降解有關；類黃酮的含量很高，但卻與內外果皮的CMYK值均無顯著相關，說明圓齒野鴉椿果實發育過程中，類黃酮出現了較為復雜的變化，可能會有新黃酮類物質產生同時伴隨某些黃酮類物質消解；花青素的含量與內外果皮的C值呈顯著負相關，而與外果皮的M值、內果皮的M、Y值呈顯著正相關，說明果實由綠轉紅的過程中，可能與花青素的積累有關。

表3 果實色素間及色素與CMYK值間的關系?Table 3 The relationship between fruit pigments and CMYK value

3 討論與結論

為了減少外界環境和主觀因素的影響，近年來，數碼技術已經開始運用在植物色彩的描述上，如利用數碼技術描述觀賞海棠的色彩[14]、測定板栗果實的褐變[20]、描述芒果花瓣和花藥的色彩[21]等。因此本試驗利用數碼測色法觀測圓齒野鴉椿果實色澤的變化，結合實際內外果皮的顏色的變化（綠色→紅＋綠→紅色），發現果皮的綠色與C、Y值關系密切，而果皮的紅色是由M、Y值起決定作用的。CMKY值與色素含量相關性分析也表明，果實發育過程中逐漸下降的葉綠素和類胡蘿卜素含量，與果皮的C值均呈顯著正相關，與M值呈顯著負相關，而果實發育過程中逐漸升高的花青素的含量與果皮的C值呈顯著負相關，而與果皮的M值顯著正相關，說明果實由綠轉紅的過程中，可能與葉綠素和類胡蘿卜素的降解，并伴隨著花青素的積累有關。

相關的研究表明，果實中含有葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮（花青素為類黃酮物質）等多種色素，在果實發育的過程中，因各部分色素不斷代謝使果實的顏色發生變化。本研究表明，圓齒野鴉椿果實逐漸成熟的過程中，果皮呈現綠色→紅＋綠→紅色的色彩變化。隨著圓齒野鴉椿果實的成熟，各色素的變化呈現一定的規律，其中葉綠素和類胡蘿卜素的含量均呈逐漸下降的趨勢，且兩者呈顯著正相關，可能在合成代謝過程中二者有良好的協同作用，類胡蘿卜素對葉綠素分子有保護作用，具體作用機理有待進一步研究；花青素則出現逐漸上升的趨勢，與其它色素含量呈負相關，其中與類胡蘿卜素、葉綠素負相關顯著，結果與李果[22]、山楂[23]等的研究結果一致，說明果實呈色過程中，葉綠素和類胡蘿卜的含量逐漸減少，伴隨著花青素的增加，花青素的積累與果實逐漸變紅可能有密切的聯系；類黃酮含量出現先下降后上升再下降的S型變化趨勢，分別在盛花期后50和130 d出現峰值，說明果實發育過程中可能會產生新的黃酮類化合物，并伴隨著某些類黃酮物質的消解，這在黃酮類物質顯色反應中得到相互印證，類黃酮的變化與花青素的變化沒有顯著相關性，這與蘋果[24]色素的研究結果一致，可能是隨著果實的成熟，果實中花青素含量不斷升高，光合產物流向花青素的合成途徑，減緩了酚類物質的合成，從而使果實中類黃酮含量較穩定。

綜上所述，本試驗利用傳統的方法對圓齒野鴉椿果皮色素的組成及含量進行了初步定性、定量分析，但要對色素進行精確的定性及定量分析還需要利用更精準的現代技術，如利用HPLC和LC-MS等，而且本試驗的試驗材料采自清流，還需采集多個地方的圓齒野鴉椿果實觀測其呈色變化，以便對圓齒野鴉椿果實顏色著色機制有更全面和精確的了解。