P物質通過p38MAPK途徑激活小膠質細胞參與大鼠熱痛敏感的形成

尹藝儒,米鵬霞,張 宇,張 策,趙 欣*

(1山西醫科大學轉化醫學研究中心,太原 030001;2山西醫科大學生理學系;*通訊作者,E-mail:xinzhao2006@163.com)

慢性疼痛嚴重影響人類的身心健康,降低患者的生活質量。研究表明,慢性疼痛的產生脊髓以及脊髓上的不同中樞的痛敏有密切關聯[1]。基于神經元及環路對痛覺在慢性疼痛的研究取得了巨大成果,在此基礎上研發的藥物也已很多,但臨床應用的效果卻不夠好,表現為對嚴重疼痛的鎮痛效果不好,或易產生藥物依賴。

中樞神經系統由神經元和神經膠質細胞組成。神經膠質細胞的數量遠大于神經元,主要有星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞等。近年來研究發現[2],小膠質細胞作為中樞神經系統內的免疫細胞,其異常活化在疼痛、阿爾茨海默癥等神經系統疾病的發生與進展中發揮了非常重要的作用,但作用機制卻不清楚。

P物質是最重要的痛相關神經遞質,由11個氨基酸組成,其受體是神經激肽-1(NK-1)。背根神經節及初級傳入纖維中P物質含量很高,主要存在于無髓的C纖維和細的有髓A-delta纖維中。外周組織受到傷害性刺激后會引起脊髓內多種神經元釋放P物質[3]。P物質被釋放后通過NK1激活多種信號通路[4],從而將傷害性刺激傳入中樞神經系統,在痛覺形成中發揮重要作用。

研究發現,脊髓小膠質細胞上也有NK1受體[5,6],并與炎癥反應引起的脊髓水平的信號轉導有關[6]。在體動物實驗表明,脊髓蛛網膜下腔注射P物質可以促進p38MAPK磷酸化,從而參與痛反應[7]。然而,該磷酸化是發生在神經元還是小膠質細胞并不清楚。本實驗采用體外培養的原代小膠質細胞,排除在體環路中神經元與小膠質細胞共存的影響因素,通過免疫熒光化學法和動物行為變化直接觀察脊髓小膠質細胞的活化方式,以及是否通過該活化方式激活的脊髓小膠質細胞參與痛覺敏感形成。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

本實驗采用180-200 g的SPF級雄性SD大鼠進行動物行為學實驗。

主要試劑:Hank’s平衡鹽溶液(武漢博士德,pH=7.0);0.25%Trypsin-EDTA(Gibco,USA);完全培養基：10%胎牛血清,89% DMEM(高糖,Hyclone,USA),1%青鏈霉素(索萊寶);小鼠抗OX-42(Invitrogen,USA);兔抗P-p38:(Cell Signal,USA);Alex fluo 488標記的驢抗大鼠IgG (Invitrogen,USA);Alex fluo 594標記的驢抗兔IgG(Invitrogen,USA);DAPI(索萊寶);熱痛刺激儀(IITC Model 39 Hot Plate,USA)。

主要儀器:熱痛刺激儀(IITC Model 39 Hot Plate,USA)。

1.2 原代脊髓小膠質細胞培養

原代培養的脊髓小膠質細胞取自出生24 h內的SD大鼠乳鼠。將乳鼠斷頭,用手術刀從背部沿脊髓劃開皮膚和脊柱,取出脊髓,置于0 ℃的Hank’s平衡鹽溶液中。剝去腦脊膜,將脊髓切成1 mm3的小塊放入含有0.25%的Trypsin-EDTA,37 ℃消化15 min。加入等體積的完全培養基終止消化,用巴斯德管吹打,靜置3 min將上層細胞懸液通過200目尼龍網過濾到50 ml離心管中。將未吹散的剩余組織加入2 ml全培液,重復上述操作,直到沒有明顯的組織塊剩余,重復操作3次。1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入新鮮全培液重懸細胞,并將其置于25 cm2細胞培養瓶中培養,細胞密度為5×105個/cm2,每隔2-3 d換液1次。培養14 d后,將細胞放在37 ℃恒溫搖床上以180 r/min振搖2 h,將懸浮于溶液中的細胞轉移到24孔板中培養。培養2 d之后,培養的細胞約95%為小膠質細胞。

1.3 P物質培養細胞實驗分組

細胞培養液為陰性對照組,將P物質根據不同濃度(200,400,800 μmol/L)分三組,分別在不同孵育時間點(2,6,12,24 h)進行免疫熒光化學實驗。

1.4 OX-42、P-p38MAPK免疫熒光檢測實驗

用Hank’s緩沖液漂洗小膠質細胞3次,每次3 min;4%的多聚甲醛固定20 min,漂洗3次;0.5% triton X-100溶液孵育5 min,漂洗3次;加入5% BSA封閉1 h;加入一抗孵育(小鼠抗OX-42:兔抗P-p38,4 ℃過夜;漂洗3次,室溫下二抗閉光孵育1 h(Alex fluo 488標記的驢抗大鼠IgG,Alex fluo 594標記的驢抗兔IgG;漂洗3次;最后用DAPI孵育5 min,漂洗3次;用熒光顯微鏡進行觀察并拍照。

1.5 活化脊髓小膠質細胞大鼠鞘內注射實驗

將原代培養的脊髓小膠質細胞按照以下兩組處理方法進行預處理。對照組用完全培液孵育脊髓小膠質細胞;P物質組根據前期結果提示,選取用400 μmol/LP物質,孵育12 h活化小膠質細胞。將按照上述兩組方法預處理過的細胞棄去孵育液,Hank’s漂洗3次,用細胞刮將小膠質細胞輕輕刮下并用生理鹽水重懸,將2×104個細胞重懸于10 μl生理鹽水中,將重懸的細胞分別經L5-L6椎間孔注入已被異氟烷麻醉大鼠的腰膨大部位處的蛛網膜下腔,最后用10 μl生理鹽水沖洗注射用PE-10管以保證細胞完全注入,待大鼠清醒后分別于注射細胞后6,12,24 h測定痛行為。

1.6 大鼠痛行為測定

采用熱痛刺激儀測定動物痛行為。在測試前,動物預適應測試環境3 d。熱痛刺激儀的溫度設定為52 ℃,此時正常大鼠的縮足反射潛伏期(PWL)值穩定在10-12 s之間。測試時將動物置于熱盤上的有機玻璃罩內,測定大鼠腳掌落在熱盤上至后腳掌抬起的間隔時間,即縮足反射潛伏期(PWL),作為動物對熱刺激的反應指標。如果在20 s時大鼠后腳掌仍未抬起,將其從有機玻璃罩內移出以避免腳掌組織損傷。每只大鼠測定3次,間隔10 min,取平均值。大鼠痛行為的測定在細胞注射前一天和注射后6,12,24 h進行。

1.7 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件對結果進行統計學分析,實驗結果以均數±標準差表示,組間比較采用One-Way ANOVA分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P物質激活脊髓小膠質細胞

利用免疫細胞化學檢測小膠質細胞特異性標記物OX-42的表達,觀察經P物質作用后脊髓小膠質細胞的形態改變。以全培液為空白對照,200 μmol/L P物質作用于原代培養的脊髓小膠質細胞,所有測定的時間點細胞都未發生形態改變。400 μmol/L P物質作用6 h,細胞開始出現胞體變大,突起縮短,OX-42表達增強。800 μmol/L P物質作用于細胞后,從2 h開始,細胞OX-42免疫染色增強,但多數細胞的形態已不完整,有細胞碎片產生(見圖1)。

2.2 P物質誘導脊髓小膠質細胞p38MAPK的磷酸化

利用免疫熒光雙標檢測,用特異性抗體OX-42和P-p38共同標記離體培養的脊髓小膠質細胞,并用DNA染料DAPI標記活細胞的細胞核。通過熒光顯微鏡觀察發現400 μmol/L P物質孵育小膠質細胞15 min,胞內p38MAPK就開始發生磷酸化(見圖2)。

A.空白對照組;B. 200 μmol/L P物質孵育2 h后的小膠質細胞;C. 400 μmol/L P物質孵育6 h的小膠質細胞;D. 800 μmol/L P物質孵育2 h的小膠質細胞圖1 P物質對小膠質細胞活化的作用觀察 (bar=50 μm)Figure 1 The effect of substance P on the activation of microglia (bar=50 μm)

2.3 P物質活化的脊髓小膠質細胞對動物痛行為的影響

P物質對脊髓小膠質細胞激活的有效濃度為400 μmol/L,用400 μmol/L P物質孵育活化的小膠質細胞注入大鼠脊髓6 h PWL為8.65 s±0.35 s,與注射前(10.91 s±0.51 s)相比明顯縮短并可持續至24 h(7.38 s±0.29 s),而對照組則變化不明顯,并迅速恢復(見圖3)。

3 討論

已有研究證實,慢性疼痛發生時的神經元功能變化與脊髓膠質細胞的活化有著密切的關系。在炎癥[8,9]和神經損傷[10-12]發生后,動物表現出慢性疼痛的癥狀,與此同時脊髓內的小膠質細胞發生活化[13],呈現出胞體肥大,突起回縮,表面標記蛋白表達增多等表現。鞘內預先應用抑制小膠質細胞代謝的藥物(例如minocycline)可以緩解慢性疼痛(包括神經病理痛、炎性痛和術后痛)的發生[14]。動物在體研究發現,痛刺激(包括神經損傷、炎癥、骨癌、阿片耐受)可以促進小膠質細胞合成細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-18)、神經營養因子BDNF、蛋白酶cathepsin S[15]等,這些物質被稱為膠質介質,這些膠質介質的釋放改變了脊髓內神經元周圍的內環境,神經元功能隨之發生變化,最終導致脊髓中樞敏感化和慢性疼痛的形成[16]。因此,脊髓小膠質細胞的活化在痛覺敏感作用的形成和加強過程發揮了非常重要的作用。

A.離體培養的原代培養的脊髓小膠質細胞P物質孵育培養15 min,經特征性標志物OX-42標記;B.同一組小膠質細胞P物質孵育培養15 min經p-p38MAPK抗體標記;C.DAPI標記細胞核;D.圖A和圖B merge的結果,顯示了該組細胞共表達OX-42和P-p38MAPK兩種抗原的情況圖2 P物質對小膠質細胞p38 MAPK磷酸化的作用 (bar=50 μm)Figure 2 Effect of substance P on phosphorylation of p38 MAPK in microglia (bar=50 μm)

與注射前(0 h)比較,*P<0.05圖3 P物質活化的小膠質細胞對大鼠痛行為反應的影響Figure 3 Effect of activated microglia by substance P on PWL of rats

現有實驗體系通常觀察的是由神經元和神經膠質細胞共同組成的復雜網絡,觀察到的是傷害信號促使神經元和膠質細胞相互作用對中樞神經系統共同產生的影響,無法觀察神經膠質細胞直接參與痛覺敏感的作用及機制。因此,本研究通過離體培養脊髓小膠質細胞作為研究模型,避免了現有實驗只能觀察到神經系統中各種神經細胞相互作用對小膠質細胞影響的局限性,可以提供脊髓小膠質細胞參與痛覺敏感作用的直接證據。

已有研究發現在中樞神經系統內神經膠質細胞也表達有NK1受體[17]。因此,作為傷害性信號在脊髓水平傳遞的神經遞質,P物質可能會通過直接作用于小膠質細胞上的NK1受體,影響小膠質細胞的功能。本研究觀察到,P物質孵育后的小膠質細胞胞體變大,標記性蛋白OX-42表達增多,提示P物質可以通過NK1受體誘導小膠質細胞由靜息態轉化為激活態。已有研究的結果也提示,鞘內注射P物質可引起動物痛反應并與p38MAPK磷酸化有關[18]。但是,無法明確是神經元還是小膠質細胞通過p38MAPK磷酸化發揮了作用。所以,本研究采用免疫細胞化學方法,檢測了離體培養的原代脊髓膠質細胞被P物質激活后,小膠質細胞內p38MAPK磷酸化水平明顯升高。說明被P物質激活的小膠質細胞p38MAPK磷酸化是由小膠質細胞自身激活而實現。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一員,MAPK在神經元和膠質細胞的胞內信號轉導中發揮著重要作用。p38MAPK的磷酸化則局限地發生在小膠質細胞[19],而非星形膠質細胞和神經元[8,20]。磷酸化的p38可以啟動細胞內很多物質的基因表達,包括細胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)[21]、COX-2[22]、iNOS[23]和其他與炎癥相關的黏附分子[24]的表達。因此,p38MAPK是小膠質細胞調控痛信號關鍵的胞內信號分子。

將用P物質刺激活化的小膠質細胞注入脊髓蛛網膜下腔,檢測動物痛行為,結果觀察到大鼠熱痛測試的縮足反射潛伏期與對照組相比顯著縮短,說明注入經P物質活化的小膠質細胞誘導產生熱痛覺敏感行為。

綜上所述,本研究在離體培養的條件下觀察到P物質可直接刺激活化小膠質細胞,促進胞內p38 MAPK的磷酸化,進而促進炎性因子的合成釋放和其他神經細胞的活化,最終共同導致脊髓水平中樞敏感化的形成,促使大鼠產生痛覺敏感的行為。本研究結果為P物質通過直接激活脊髓小膠質細胞p38 MARK信號通路參與大鼠痛覺敏感作用提供證據。