Alphastatin多肽聯合紫杉醇對裸鼠卵巢癌的治療作用

尉春艷,彌少茹,常 健,張 熙

(1西安交通大學第二附屬醫院婦產科,西安 710004;2陜西省澄城縣醫院婦產科;3西安交通大學第二附屬醫院神經外科;*通訊作者,E-mail:weichy1023@163.com)

卵巢癌是最常見的女性惡性婦科腫瘤,其治療方案主要是手術、化療和放療。由于卵巢癌發病隱匿,明確診斷時往往已經是晚期,死亡率高,預后差。在這種情況下,化療對于這一類患者尤為重要。紫杉醇聯合鉑類的治療是卵巢癌的一線化療方案,大部分的卵巢癌患者最初對聯合化療敏感,但大約15%首次診斷為卵巢癌的患者即對此方案無反應,60%以上的復發卵巢癌也表現出對該化療方案的耐藥性[1]。如何提高患者對化療方案的敏感性對于提高卵巢癌患者的預后十分重要。有研究表明,腫瘤新生血管對于腫瘤的生長十分重要。化療藥物能夠導致血管內皮細胞損傷,凋亡,導致新生血管明顯減少。但是化療結束后2-3周血管內皮細胞會緩慢修復,這可能是卵巢癌對化療耐藥的原因之一[2]。因此,抑制血管生成可能能提高卵巢癌的化療效果。本研究擬用血管抑制多肽alphastatin聯合紫杉醇,觀察該方案對卵巢癌的治療效果。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人卵巢癌細胞株SKOV3購于中科院上海細胞庫。紫杉醇購自江蘇奧賽藥業,alphastatin多肽序列為ADS GEG DFL AEG GGV RGP RVV ERH,純度為95%,由上海吉爾生化有限公司合成。鼠抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)購自美國Santacruz公司,AKT和PI3K抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養

用含10%小牛血清的1 640培養基培養人卵巢癌細胞株SKOV3,于37 ℃,5% CO2培養、常規傳代,待細胞生長至取對數生長期,0.25%胰蛋白酶進行消化,用PBS制成細胞懸液,調整細胞密度至3×107/ml,為構建動物模型做準備。

1.3 實驗動物及動物模型建立

4-6周雌性裸鼠,質量14-17 g,購于西安交通大學動物實驗中心。將SKOV3細胞(6×106個/只)接種于裸鼠左側大腿皮下,2周后取出原代移植瘤,分成0.5 cm×0.5 cm小塊,種植于實驗用裸鼠左側大腿皮下。種植2周后選取皮下移植瘤體積150-200 mm3的裸鼠32只,隨機分為4組,即對照組,alphastatin組,紫杉醇組,聯合治療組,每組8只。alphastatin組每隔2 d腹腔注射alphastatin多肽1次,每次0.25 mg/kg,一共6次。紫杉醇組尾靜脈注射紫杉醇溶液,按20 mg/kg給藥,每隔2 d注射1次,共6次。聯合治療組每隔2 d腹腔注射alphastatin多肽同時尾靜脈注射紫杉醇溶液,劑量如前。對照組注射等體積的PBS溶液。注射藥物30 d處死裸鼠,取出移植瘤,測量移植瘤體積和質量。體積=0.5×長徑×短徑2。

1.4 計算微血管密度

固定腫瘤組織,石蠟包埋并切片,采用鏈霉素抗生素-過氧化物酶法(SP法)檢測CD34的表達,按照CD34免疫組化試劑盒步驟操作,以細胞質出現棕黃色著色判斷為血管內皮細胞陽性。高倍顯微鏡下隨機選擇5個視野,計數每個視野下MVD的數目后,然后計算MVD平均數目。

1.5 AKT-PI3K通路的檢測

采用Western blot檢測VEGF、AKT和PI3K蛋白的表達。提取腫瘤蛋白,并轉移至PVDF膜,將PVDF膜加入到封閉液中,37 ℃搖床2 h。將PVDF膜從封閉液中取出,用TBST液清洗,清洗干凈后加入一抗,鼠抗人VEGF,AKT和PI3K抗體,4 ℃過夜。將PVDF膜放入37 ℃恒溫箱中1 h,加入TBST清洗2次,每次15 min,然后用TBS清洗1次,15 min。加入二抗,室溫下孵育2 h,再次加入TBST清洗2次,每次15 min,然后用TBS清洗1次,15 min。封閉后加入二抗,室溫下孵育2 h,化學發光顯色,以β-actin為內參校正。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組裸鼠移植瘤體積、質量和抑瘤率

應用alphastatin或者紫杉醇治療后,腫瘤的體積和質量顯著降低,與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05),聯合紫杉醇和alphastatin治療后,腫瘤的體積和質量明顯減少,與對照組、alphastatin組或者紫杉醇組比較,差異均有統計學意義(P<0.01,見表1)。

表1各組腫瘤體積,質量和抑瘤率比較

Table1Comparisonoftumorvolume,weightandinhibitionrateamongfourgroups

組別腫瘤體積(cm3)腫瘤質量(g)抑瘤率對照組1.21±0.282.16±0.47—alphastatin組0.73±0.15*1.36±0.31*37.0%紫杉醇組0.81±0.22*1.83±0.28*33.1%紫杉醇+alphastatin組0.34±0.12*#0.69±0.09*#68.1%

與對照組比較,*P<0.01;與alphastatin組或者紫杉醇組比較,#P<0.01

2.2 各組裸鼠移植瘤中微血管密度

應用alphastatin或者紫杉醇治療后,微血管密度明顯減少(見圖1),與對照組比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。alphastatin聯合紫杉醇治療后,微血管密度明顯減少,與對照組、alphastatin組和紫杉醇組比較,差異具有統計學意義(P<0.05,見表2)。

2.3 各組裸鼠移植瘤中VEGF、AKT和PI3K蛋白的表達水平

紫杉醇或者alphastatin均能抑制VEGF、AKT和PI3K蛋白的表達,但是聯合紫杉醇和alphastatin多肽后VEGF、AKT和PI3K蛋白的表達進一步降低,與其他三組分別比較,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2)。

A.對照組;B.alphastatin組;C.紫杉醇組;D.紫杉醇+alphastatin組圖1 不同處理方法后MVD的變化 (×40)Figure 1 Changes of MVD after different treatment (×40)

表2應用alphastatin、紫杉醇以及聯用alphastatin和紫杉醇后各組腫瘤的微血管密度

Table2ComparisonofMVDamongfourgroups

組別微血管密度 對照組28.66±5.26 alphastatin組17.53±3.54* 紫杉醇組17.13±3.33* 紫杉醇+alphastatin組19.69±2.24*#

與對照組比較，*P<0.01；與紫衫醇組和alphastatin組比較，#P<0.01

3 討論

由于卵巢癌呈侵襲性生長,手術難以做到細胞水平的全切,所以術后化療在卵巢癌的治療中起著十分重要的作用。目前常用的化療方案是順鉑加紫杉醇,但是在臨床工作中發現,卵巢癌對化療有抵抗性。卵巢癌的化療抵抗機制有很多,其中血管生成被認為是重要的耐藥機制[3]。有學者認為,化療藥物早期可引起腫瘤血管內皮細胞凋亡,但是化療結束2-3周后,內皮細胞就會修復。更有學者發現,紫杉醇可活化TLR4/MyD88信號通路,進而活化血管內皮生長因子(VEGF),使血管內皮細胞增殖,導致腫瘤血管生成,促進腫瘤生長,導致化療失敗[4]。目前已有研究證明,抗血管生成藥物可提高化療藥物的抗腫瘤作用[5]。但是,目前的抗血管生成藥物,包括基因治療不能特異性作用于腫瘤血管,存在明顯的副作用。

與其他三組比較，*P<0.05圖2 各組中VEGF、AKT和PI3K蛋白的表達Figure 2 The expression of VEGF,AKT and PI3K protein in ovarian cancer after different treatment

Alphastatin是人纖維蛋白氨基末端24肽,可通過抑制VEGF通路和SIP通路抑制腫瘤內部內皮細胞依賴性血管和血管生成擬態,達到抑制腫瘤生長的目的,并且對正常組織血管無明顯作用,因此具有更好的應用前景[6,7]。研究發現,應用紫杉醇化療結束約2周后可有效抑制腫瘤的生長,而聯用alphastatin和紫杉醇后,腫瘤體積明顯縮小,與單用紫杉醇或者alphastatin比較均有顯著性差異。進一步研究發現,聯用alphastatin和紫杉醇組中腫瘤內部微血管密度明顯減少。因此,在應用紫杉醇的同時應用alphastatin多肽,可提高卵巢癌的化療敏感性,達到治療腫瘤的目的。

研究表明,VEGF/AKT/PI3K信號通路在卵巢癌中呈異常活化狀態,在抗細胞凋亡,促進癌細胞增殖方面起著十分重要的作用,是卵巢癌化療耐藥的重要原因[8]。前期研究證明,alphastatin多肽能夠抑制VEGF及其下游通路的活性[9],并且鞘氨醇可通過AKT/PI3K通路發揮其生物學作用。本研究發現,單用紫杉醇或者alphastatin后,可明顯抑制VEGF、AKT和PI3K蛋白的表達,加用alphastatin多肽后,能夠進一步抑制VEGF/AKT/PI3K信號通路的活性,兩者具有協同效應。因此,聯用alphastatin多肽和紫杉醇化療,可協同抑制VEGF/AKT/PI3K信號通路,抑制腫瘤內部血管生成,導致化療增敏,達到更好地治療卵巢癌的作用。