人參總皂苷對大鼠急性心肌梗死模型血管新生及心功能的影響研究

（云南省臨滄市農業學校，云南臨滄 677000）

急性心肌梗死（AMI）是世界范圍內有著有著較高致殘甚至致死率的疾病類型。現階段，在臨床中，多采用手術、介入、藥物等方式治療AMI，但無論采用何種方式，其治療目的無外乎是抑制心律失常，改善心肌缺氧、缺血，使心臟灌注始終處于良好狀態[1]。雖然有著比較多的治療方案，但其中的大部分治療方法，均難以實現對梗死的心肌等進行有效修復。針對由AMI所引起的自發性血管新生反應而言，其實為一個比較典型的帶有慢性、保護性特點的反應過程，僅能對阻塞冠脈下的心肌進行部分補充，而難以達到完全修復[2]。針對人參等中藥材而言，其經常被用作心腦血管疾病、糖尿病、肝肺纖維化等的預防與治療。人參當中含有豐富的黃酮、糖、皂苷等，而主要活性成分為皂苷。人參總皂苷（TG）包含40多種皂苷單體（Rb1、Rg1等），其中，Rb1等對心肌細胞凋亡有抑制作用，還能使內皮細胞大量釋放一氧化氮[3]。本文針對TG對心肌梗死后血管新生心室重構以及對心功能的影響作一探討。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

♂（Sprague-Dawley，SD）大鼠，月齡區間為2～3個月，體重210～240g；選用由北京天然藥物研究院所提供的TG，其主要從人參的葉、莖所提取，其中，含人參皂苷Rb15.25%，、Rd13.64%，Re21.59%，Rg15.19%，除此之外，其中還含有其他類型的人參皂類化合物。利用無菌生理鹽水配制儲存液：2、4gL-1，然后置于4℃環境中保存。選用購自大連寶生物公司的堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、VEGF以及逆轉錄試劑盒；CD31單克隆抗體（Santa Cruz公司）；選用購自美國ABI公司的SYBR GREEN PCR Mas-ter Mix。

1.2 主要儀器

實時熒光定量PCR儀（美國ABI）與2400PCR擴增儀（美國BIO-RAD）；Sequoia 512彩色多普勒超聲診斷儀（德國SIEMENS）；Ken2 Cardico302心電圖機（北京明成森木醫療公司產）；ALC-V8S小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技公司）。

1.3 心臟彩色超聲多普勒檢查及篩選

取適量水合氯醛，注射于腹腔，完成麻醉后，將大鼠擺成仰臥位，且加以固定，用硫化鈉（1.25mol·L-1）對左胸前進行退毛處理。用彩色多普勒超聲診斷儀（探頭頻率設定為15MHz）對超聲心動圖進行監測，分別取左室長軸切面與左室乳頭肌短軸切面，放大圖像，然后以M型取左室后壁，然后用同樣型狀取左室前壁。選取比較清晰的圖像進行錄像，并儲存，對所得錄像進行系統化分析測量：左室短軸縮短率（FS）、左室射血分數（EF）、收縮末期左室容積（LVESV）、舒展末期左室容積（LVEDV）、左心室收縮末期內徑（LVDs）、左心室舒張末期內徑（LVDd）。

1.4 AMI模型制備與分組

根據相關報道[4]構建AMI模型。氣管插管后，與小動物呼吸機相連接，在肺動脈圓錐與左心耳下緣之間，即距離主動脈根部大約為2～3mm位置處，對冠狀動脈左前降支實施結扎處理，如果心肌顏色變成暗紅色，或者是出現心電圖示ST段抬高，則可明確為模型制作成功（Fig1）；假手術組（sham組）共計8只，僅開胸，不進行結扎處理。將建模型成功的大鼠進行分組（3組），TG高劑量組（TG-H組），共計10只，在胸腔處注射TG40mg·kg-1·d-1；TG低劑量組（TG-L組），共計10只，相同部位注射20mg·kg-1·d-1；模型組（model組），共計12只。model組、sham組均實施生理鹽水腹腔注射，完成手術后1d，用藥，持續用藥35d。

1.5 心臟組織病理學檢查

將大鼠處死，開胸，并將心臟取出，沿著冠狀溝，將心房剪去，于結扎點下方位置，沿著冠狀面，把左心室予以橫切，使之成為兩部分，以肉眼方式對腔徑進行觀察，同時觀察心室壁變化，取心尖組織，采用多聚甲醛加以規定，然后實施脫水、石蠟包埋以及切片HE染色等處理，在顯微鏡下，對心肌組織的病理學變化進行觀察；進行Masson染色，對藍染的膠原纖維分布情況進行細致觀察，然后對心肌纖維化程度進行綜合評價。

1.6 Real-timePCR檢測基因表達

依據對應的試劑盒說明書，用TRIzol對心肌組織總RNA進行提取，運用專用型紫外分光光度計，對A260與A280比值進行測定，即1.8～2.0區間內。逆轉錄，稀釋處理，加入到cDNA中（7mgL-1），然后再將其加入到SYBR GREEN PCR Mas-ter Mix當中，開展定量PCR檢測，反應條件為：72℃，1min，4℃；60℃，20s；95℃，5min；40個循環。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 TG對AMI大鼠心功能的影響分析

相比于sham，model組LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有顯著增加（P＜0.05），而FS、EF則有顯著減小（P＜0.05），有比較明顯的左心室收縮情況，此外，舒張功能存在障礙。采用TG進行持續35d的干預后，相比于model組，TG-H組LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有顯著減小（P＜0.05），能夠準確反應左心室收縮功能的FS、EF，相比模型組，均有顯著增高（P＜0.05）；相比于model組，TG-L組的FS、EF有顯著增大（P＜0.05）。見表1。

表1 TG對AMl術后第35d大鼠心功能的影響

2.2 TG對AMI大鼠左心室組織病理學的影響

HE染色之后，在顯微鏡下進行觀察，從中得知，sham組有著比較整齊的心肌纖維排列，不存在破壞情況，且有著均勻、豐富的胞質，有著正常的細胞間隙；而對于model組，其在具體的心肌組織缺血梗死區心室壁方面，則明顯變薄，心肌纖維已經消失，且形成瘢痕；TG-H組、TG-L組相比于model組，在心室壁方面有顯著增厚，且保存著較多的心肌纖維，能觀察到諸多呈島狀的心肌組織，瘢痕面積較小。

2.3 TG對左心室心肌組織bFGFmR-NA、VEGF表達的影響

根據左心室心肌組織real-time PCR最終結果得知，model組相比于sham組，左心室心肌組織bFGF-mRNA、VEGF表達水平比較，差異不明顯；相比于model組與sham組，TG-H組與TG-L組能夠顯著提升bFGF mRNA、VEGF的表達水平（P＜0.05）。

3 討論

冠狀動脈結扎會造成心肌細胞出現不同程度的缺血壞死，由于心肌細胞存在著比較有限的再生能力，且致死區域大部分被纖維組織替代，出現心室重構情況，因而會對心臟功能造成較大程度影響。所以，增加組織血液供應以及血管新生，乃是治療AMI的核心所在[5]。由本次研究得知，TG持續用藥35d后，對大鼠AMI起到了較好的保護作用，另外，在心室重構以及心功能方面，也得到了有效改善；AMI后，大鼠FS、EF得到顯著提升，特別是高劑量組，LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有顯著減小，表明采用TG治療后，AMI大鼠心臟舒縮功80FD相比于模型組，有顯著提高。經組織病理學測定得知，TG組在具體的心肌梗死面積方面，相比未用藥前，得到顯著縮小，梗死區心肌纖維化程度比較輕，且存在著諸多心肌細胞，有著比較厚的心室壁，由此得知，TG對于AMI大鼠心室重構，具有顯著的抑制作用，這也表明TG對于心功能有較好的抑制作用。

微血管密度能夠準確折射出側支循環的最可靠指標，而梗死范圍的大小則能反映出側支循環的當前情況，且梗死面積與側支循環之間存在顯著負相關，即梗死面積越小，則側支循環便越豐富[6]。由免疫組染色結果得知，TG組大鼠梗死去的MVD顯著增加，由此得知，TG刺激AMI大鼠，使其血管新生，對構建側支循環有重要促進作用。而由Masson染色與HE染色結果也能得知，在采用TG治療后，小鼠心肌梗死區域大幅減少，而且膠原纖維也明顯減少，有著較多的存活狀態的心肌組織。由此表明，TG不僅對AMI后梗死區新生具有促進作用，而且對其周邊血管新生，同樣具有重要的促進作用，可以增加缺血區血液供應，大幅改善AMI之后的心室重構。bFGF與VEGF實為促進內皮細胞分化與生長的核心要素，在整個血管新生中，其發揮著舉足輕重的作用。當出現缺血損傷時，會一定程度上調bFGF、VEGF的表達，造成內皮細胞出現典型的有絲分裂因子活化，此情況對內皮細胞相應增長具有促進作用，還能一定程度誘導血管內皮細胞，使其不斷分化與成熟，而對于bFGF來講，其可以對整合素的表達進行上調，因而能夠大幅提升內皮細胞的遷移能力以及黏附能力，最終生成新的血管。有報道已證實，bFGF與VEGF表達上調，可以促使局部組織在灌注與代謝方面的增加，減輕缺血損傷，最終達到改善心功能的目的。由本次研究得知，TG組大鼠梗死區心肌組織bFGF mRNA、VEGF的表達，存在顯著增高，特別是高劑量組，更為顯著，由此表明，TG能夠上調AMI大鼠心肌組織當中的bFGF mRNA與VEGF表達，對缺血區血液供應有改善作用。

VEGF實為一種典型的促血管生成因子，當小鼠心肌缺血發生1d時，在梗死區表達便出現明顯升高，誘導出現帶有自發性質的血管新生，但是，當梗死持續14d時，其下降至梗死前的水平。由本實驗可知，心肌梗死35d時，模型組VEGF水平相比sham組，差異不明顯，但TG組VEGF水平卻有顯著升高。由此可知，TG處理對VEGF有刺激作用，能使其持續高表達，以此對AMI激發的自發性血管新生不足予以補充。

綜上所述，TG對改善急性心肌梗死大鼠心室重構及梗死區心肌血液供應以及心臟功能恢復，有顯著促進作用，其作用機制與上調心肌組織bFGF、VEGF基因表達相關。