動物布魯氏菌病試管凝集試驗標準比濁管最大吸光度光譜的研究

（漢臺區畜牧獸醫技術推廣中心，陜西漢中 723000）

布魯氏菌病（布病）是由布魯氏桿菌屬（Brucella）細菌引起的牛、羊、豬以及人的一種人畜共患病，被世界衛生組織（OIE）列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。人感染后引發波浪熱、關節痛、肌肉痛、睪丸炎、不孕癥等病癥，長期不愈；家畜感染則引發流產和不育，對畜牧業及人類健康造成極大危害。

國家中長期動物疫病防治規劃（2012-2020年）對各省布病防控要求分別達到控制、凈化、消滅標準，檢疫、檢測、撲殺、無害化處理是非免疫區布病凈化的主要手段，檢測結果的準確性對凈化工作至關重要。我國對動物布病的檢測方法有虎紅平板凝集試驗（RBPT）、試管凝集試驗（SAT）、補體結合試驗（CFT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和熒光偏振試驗（FPA）等。其中RBPT和SAT兩種試驗是我國目前法定的布病檢測方法，經RBPT初篩的陽性樣品，SAT確診在大部分省份，特別是基層檢測機構廣泛運用。《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646-2002）列出的SAT檢測結果判定為試驗人員肉眼比對判定，受試驗人員經驗技術、辨色力、外部環境、主觀心理因素等影響，判定結果會出現偏差或異議。

通過運用可見光（400～760nm）分光光度法改良SAT試驗判定方法對布病監測樣品進行預實驗，兩種判定結果一致，且改良后的判定方法較肉眼判定具有客觀性、判定速度顯著提高、試驗數據可保留等特點。

本試驗通過比較試管凝集試驗比濁管在405nm、450nm、490nm、630nm四個光譜OD值（吸光度），確定最大吸光度光譜，為進一步開展SAT試驗肉眼對法比與分光光度法在判定結果上出現的假陽性、假陰性、可疑樣品等指標差異研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Model酶標儀（濾光片405nm、450nm、490nm、630nm）；燒杯（0～300ml）；量筒（0～100ml）；布病凝集試管；200～1000μl移液器（大龍200～1000μl、艾本德20～200μl）；分析天平；96孔空白酶標反應板（可拆卸）。

1.2 材料

布病試管凝集抗原，生產廠家：青島易邦，批號：20150703；苯酚（石炭酸）；0.9%生理鹽水。

2 方法

（1）配制稀釋液（0.5%的石炭酸生理鹽水）。用分析天平稱取0.5g石炭酸置于250ml燒杯中，加入100ml0.9%生理鹽水，121℃高壓滅菌30min。

（2）配制工作濃度（1：20）抗原。用200～1000μl移液器向20ml燒杯中移取0.5ml布病試管凝集抗原、9.5ml0.5%石炭酸，充分混勻。

（3）配制比濁管。嚴格參照國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646-2002）中標準比濁管的配置方法。用1000～5000μl移液器吸取5ml 20倍稀釋抗原液，移至20ml燒杯中，再加入5ml稀釋液，配置成10ml（1：40）抗原稀釋液，然后將1：40抗原液和0.5%石碳酸生理鹽水分別按照1：0、0.75：0.25、0.5：0.5、0.25：0.75、0：1的加樣量加入5個比濁管，每管液體總量為1ml，配置完成后37℃環境感作20h。

（4）加樣掃描。用20～200μl移液器依次取5個不同濃度的比濁管上層液體200μl，移至空白酶標板，用Model酶標儀配備的405nm、450nm、490nm、630nm四個濾光片進行掃描，讀數并記錄。

3 結果

3.1 標準比濁管OD值掃描結果

標準比濁管在405nm、450nm、490nm、630nm四個光譜下掃描結果經方差分析，405nm光譜OD值與450nm光譜OD值差異不顯著（P＞0.05），與490nm和630nm光譜OD值差異均顯著（P＜0.05），450nm光譜OD值與490nm光譜OD值差異不顯著（P＞0.05），與630nm光譜OD值差異顯著（P＜0.05）。（見表1）。

3.2 標準比濁管OD值直線回歸結果

四個光譜OD值均呈現良好的線性關系，其中405nm光譜OD值線性關系最好（R2=0.9992）（見圖1）。

表1 標準比濁管OD值掃描結果

圖1 標準比濁管OD值線性關系

4 結論

標準比濁管0%、25%、50%、70%、100%五個抗原濃度在405nm光譜下OD值最大，且差異顯著（P＜0.05），線性關系最好。確定405nm為標準比濁管最大吸光度光譜值，在下一步研究中，統一用405nm光譜進行試驗。