超聲波對鎘脅迫鴨茅和冰草種子萌發的影響

， ， ， ， *

(1. 西北農林科技大學動物科技學院， 陜西 楊凌 712001)

土壤重金屬污染是當今環境研究的熱點問題。鎘是生物毒性最強的一個重金屬元素，我國約有1.3萬公頃的耕地受鎘污染[1]。鎘在土壤中難降解、移動性大[2]，能夠在土壤和生物體內富集，污染土壤和作物，干擾植物正常生理代謝，影響植物的生長、發育[3]、造成作物產量和品質的下降[4]，并且容易通過食物鏈的富集作用危及人類的健康，對人體具有致病、致癌、致突變作用[5]。由于多數牧草具有分蘗力強，可以通過反復刈割來降低土壤中重金屬的含量,因而牧草對重金屬污染的土壤具有一定的修復作用，近年來，國內外至少有數十種牧草開始用于重金屬污染土壤的修復上[6]，如紫花苜蓿、紅三葉、黑麥草等。鴨茅是一種良好的冬春飼草，抗寒性較好[7]，是西部退耕還草，建立林-草復合植被生態系統的重要草種[8]，冰草是一種重要的固沙植物也是一種優良飼草[9]但是關于鴨茅和冰草對重金屬污染的植物修復作用報道的很少。

因此選用耐鎘脅迫的鴨茅和冰草就顯得尤為重要。但考慮到育種花費時間長，投入人力、物力、財力大。因此選擇一種簡單、經濟的方法提高鴨茅和冰草的耐鎘能力，使其在重金屬鎘污染的土壤上能夠生長良好，再通過反復刈割從而降低土壤重金屬鎘的含量。超聲波可以用于提取污泥中的重金屬[10]，來降低土壤中重金屬的含量，從而降低土壤中過量重金屬對植物生長發育的抑制作用，提高作物產量，改善作物品質。有文獻報道稱植物種子經超聲波發生儀處理后，可以提高種子活力、促進種子萌發及幼苗生長、增加植物的抗逆能力及產量[11-14]，超聲波也可以促進生物質轉變為生物能源[15-16]。但是，關于超聲波處理下重金屬脅迫的報導很少。因而本實驗擬在前人的基礎上研究重金屬鎘脅迫下超聲波對鴨茅和冰草發芽率、胚芽長的影響以及鴨茅幼苗中過氧化物酶(peroxidase, POD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的影響，為其進一步利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取2013年收獲的純凈、無雜質的鴨茅和冰草種子作為試驗材料。試驗在西北農林科技大學草業科學實驗室2016-2017年進行。儀器包括：分光光度計、超聲波發生儀、分析天平等。

1.2 種子發芽培養與處理方法

試驗前先用蒸餾水浸泡種子3 h，然后用10%的H2O2溶液消毒20 min，最后用蒸餾水沖洗3～4次。把兩種種子各分成六份，分別用超聲波處理0、5、10、15、25、35 min。

種子采用培養皿紙上發芽法進行發芽處理，每個培養皿均放置五十粒種子。試驗設計為，種子經不同時長超聲波處理(0、5、10、15、25、35 min)后，每天對其澆灌定量不同濃度的氯化鎘溶液(0.00%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)，共36個處理，每一個處理均重復3次。種子萌發及幼苗生長均在溫室中進行(溫度25℃，光照30.05 lx)。培養20天后統計發芽率、胚根長、胚芽長以及測定鴨茅幼苗中不同處理下的生理指標，取3個重復值得到平均值進行相關指標的分析。

表1 對鴨茅和冰草種子的處理方法Table 1 Treatments on the seeds of D. glomerata and A. cristatum

1.3 生理生化指標的測定

每天都統計兩種種子的發芽勢，20天后統計各個處理下的發芽率、胚芽長、胚根長以及鴨茅幼苗中POD活性、MDA含量。其中POD的活性采用愈創木酚法測定[17]，MDA的含量采用硫代巴比妥酸法測定[18]。

1.4 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2007軟件和SAS軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 各處理對鴨茅和冰草種子發芽率的影響

鴨茅種子經超聲波處理后，均能夠促進種子發芽率，在超聲波處理5、10、15min顯著提高種子的發芽率(表2)。其中以超聲波處理5 min(處理2)效果最明顯，種子發芽率比對照組高出18.67%。冰草種子比鴨茅種子發芽率低，冰草種子經超聲波處理后，在超聲波5 min的處理下促進種子發芽率，比對照組高出4.00%，而其余時間的處理均抑制冰草種子的發芽率，在超聲波35 min處理下(處理6)冰草種子發芽率最低，比對照組低出4.00%(表2)。

在單一鎘溶液的處理下，相比于對照組，五種不同濃度的鎘處理均抑制鴨茅種子的發芽(表2)。當鎘溶液的濃度大于0.03%(處理9)時顯著抑制。抑制程度和鎘溶液的濃度不是呈現單一的線性關系。當鎘溶液的濃度為0.01 %(處理7)時抑制程度最大，發芽率僅為對照組的3.33%。對于冰草種子，在鎘溶液的濃度為0.04%(處理10)時，促進冰草種子發芽，比對照組高出18.00%，其余濃度的鎘處理效果不顯著。

表2 單一超聲波或者鎘處理對鴨茅和冰草種子發芽率的影響Table 2 Effects of individual sonication or Cd+ treatment on seed germination of D. glomerata and A. cristatum/%

注：平均值±標準誤

Note：Average value±Standard error

由表3可知，超聲波和鎘處理對鴨茅種子發芽率的交互作用在超聲波時長為5min和鎘溶液的濃度為0.02%時發揮的效果最大。由表4可知，超聲波和鎘處理對冰草種子交互作用的效果在超聲波時長為10 min和鎘溶液的濃度為0.01%時發揮的效果最大。

表3 超聲波和鎘處理對鴨茅種子發芽率的交互作用Table 3 Interacts of sonication and cadmium stress on germination percentage in D.glomerata

表4 超聲波和鎘處理對冰草種子發芽率的交互作用Table 4 Interaction of sonication and cadmium stress on seed germination rateof A. cristatum

由圖1可知，當鎘溶液濃度為0.01%時，五種不同時長的超聲波均提高鴨茅種子的發芽率，在超聲波處理10 min時，發芽率達到最大為68.67%。當鎘溶液濃度大于0.01%時，不同時長的超聲波處理對鴨茅種子的發芽率影響不同，但都在超聲波10

min時有促進作用。對于冰草種子而言，在鎘溶液的濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04 %時，各超聲波處理促進效果不顯著或者表現為抑制作用，但在鎘溶液濃度為0.05 %時，各超聲波處理均顯著促進。

圖1 超聲波和鎘溶液的組合處理對鴨茅和冰草種子發芽率的影響Fig.1 Effects of combining sonication and cadmium on seed germination rate of D glomerata and A cristatum注：*表示交互作用，下同Note:*indicates interaction, the same as below

2.2 各處理對鴨茅和冰草幼苗胚芽生長的影響

由圖2可知，單一超聲波處理下，超聲波10 min可以促進鴨茅和冰草幼苗的生長，但各超聲波處理對鴨茅和冰草幼苗生長均表現為促進效果不顯著，在超聲波5 min時顯著抑制鴨茅幼苗生長，在超聲波35 min時顯著抑制冰草幼苗的生長。單一鎘溶液處理下，五種不同濃度的鎘溶液均顯著抑制鴨茅幼苗生長，對冰草幼苗生長也均表現為抑制作用。鎘溶液和超聲波交互處理鴨茅時，對于鴨茅幼苗而言：當鎘溶液的濃度為0.01%時，不同時長的超聲波處理均顯著促進鴨茅幼苗的生長，當鎘溶液的濃度大于0.01 %時，各超聲波處理對鴨茅胚芽生長均表現為抑制作用或促進效果不顯著。對于冰草幼苗而言，當鎘溶液的濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%時，各超聲波處理對冰草幼苗胚芽的生長均表現為抑制作用或促進效果不顯著，當鎘溶液的濃度為0.05%時，各超聲波處理顯著抑制冰草幼苗的生長。

由表5可知，超聲波和鎘交互處理對鴨茅胚芽的生長在超聲波時長為5 min和鎘溶液的濃度為0.02 %時發揮的效果最大。由表6可知，超聲波和鎘的交互處理對冰草胚芽的生長在超聲波時長為10 min和鎘溶液的濃度為0.05%時發揮的效果最大。

2.3 各處理對鴨茅幼苗中POD活性的影響

在圖3中，單一超聲波處理下，與對照組相比，各超聲波處理均提高鴨茅幼苗中POD的活性，在超聲波處理5 min和35 min時，促進效果顯著，超聲波5 min處理下POD活性最大為228.72 μg·g-1FW·min-1。單一鎘溶液處理下，鎘溶液濃度為0.02 %時顯著提高鴨茅幼苗POD的活性。鎘溶液與超聲波交互處理鴨茅時：當鎘溶液的濃度為0.01 %時，各超聲波處理均顯著提高鴨茅幼苗中POD的活性，且隨著超聲波處理時間的增長，POD活性逐漸降低，在超聲波5 min處理下，鴨茅幼苗中POD的活性最大為374.905 μg·g-1FW·min-1。

2.4 各處理對鴨茅幼苗中MDA含量的影響

在圖3中，單一超聲波處理下，與對照組相比，各超聲波處理均使鴨茅幼苗中MDA的含量增加。單一鎘溶液處理下，對鴨茅幼苗中MDA的含量表現為抑制或增加效果不顯著。兩種處理交互作用下，當鎘的濃度為0.01 %時、超聲波25 min處理的鴨茅幼苗中MDA含量最少，當鎘的濃度為0.02 %時、超聲波15 min處理的鴨茅幼苗中MDA含量最少。當鎘的濃度為0.03、0.04 %時，超聲波處理均顯著降低了鴨茅幼苗中MDA的含量。

圖2 各處理對鴨茅幼苗胚芽長的影響Fig.2 Effects of different treatments on plumule length of D glomerata and A cristatum seedlings

圖3 各處理下鴨茅POD活性、MDA含量的變化Fig.3 Effects of different treatments on POD activity、MDA content in D glomerata seedlings

表5 超聲波和鎘處理對鴨茅胚芽長的交互作用Table 5 Interaction of sonication and cadmium stress on plumule length of D. glomerata

處理Treatments2Time of sonication,5 min310 min415 min525 min635 min7 Cd2+, 0.01%1.28 1.68 1.48 -0.07 -0.64 80.02%1.12 0.76 -0.73 -0.27 -0.45 90.03%-1.13 1.07 -1.14 -1.00 1.09 100.04%-1.09 -0.25 -0.33 0.38 -0.02 110.05%-0.71 -0.58 0.20 -0.25 -0.40

表6 超聲波和鎘處理對冰草胚芽長的交互作用Table 6 Interaction of sonication and cadmium stress on plumule length of A. cristatum

3 討論

3.1 超聲波對發芽率、胚芽生長以及鴨茅幼苗POD活性、MDA含量的影響

超聲波實際上是把電能轉變為超聲震蕩形式的動能傳入種子的細胞中，刺激生命運動的增強，加速種子內部的生理生化反應[19]。本試驗采用五種不同時長的超聲波處理鴨茅種子，結果表明；這五種時長的超聲波均促進鴨茅種子的發芽，且在5 min時鴨茅發芽率達到最大。冰草種子發芽率較低，且僅在超聲波5 min處理下，發芽率提高。有研究表明一定時長的超聲波處理某種種子可以打破該種子的休眠，如張文明等研究結果發現當超聲波處理水稻種子5～10 min時促進其發芽率[20]。在播種之前采用一定時長的超聲波處理種子，可以提高種子發芽率，達到增收的效果。

本試驗發現同一超聲波處理鴨茅種子，5 min時促進鴨茅種子的發芽率但是卻抑制鴨茅胚芽的生長，試驗表明超聲波對鴨茅發芽率和胚芽生長之間不是共同促進的作用。超聲波35 min時抑制冰草胚芽的生長。莊南生等研究結果表明：一定時間的超聲波處理可以促進植物胚芽的生長[21]。Wang[22]等研究結果表明在超聲波溫度為39.7℃、處理時長為22.5 min、輸出功率為348W時柳枝稷胚芽生長最好，因此可以繼續研究找到可以同時促進鴨茅種子或冰草種子發芽率和胚芽長的超聲波時長，來使得田間出苗更快更整齊。

POD是清除活性氧系統中的重要酶，有抑制膜脂過氧化，延緩細胞衰老的作用[23]，還能促進細胞生長、是重要的防御機制[24].本試驗表明五種不同時長的超聲波均提高鴨茅幼苗中POD的活性，其中在超聲波5 min時POD的活性最高。孫立軍等研究表明當超聲波處理30 min的人參種子時其幼苗中POD的活性最高[25]。因此，一定時長的超聲波處理特定種子，有利于提高該種子幼苗中POD的活性，從而起到保護該幼苗細胞的作用。

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷等多種生物學功能的惡化[26]。本次試驗所設置的超聲波時長均使鴨茅幼苗中丙二醛的含量增加，說明單一超聲波處理會破壞鴨茅的膜系統。趙奇等研究結果表明超聲波可以降低青椒丙二醛的含量[27]。這可能是由于材料及時間等不同造成的。

3.2 鎘脅迫對發芽率、胚芽生長以及鴨茅幼苗POD活性、MDA含量的影響

本試驗設置的不同濃度的鎘處理鴨茅和冰草種子時，鴨茅和冰草種子經鎘脅迫處理后，除0.04%的鎘處理提高冰草種子發芽率，其余均表現為抑制種子發芽率。五種不同濃度的鎘溶液均顯著抑制鴨茅幼苗的生長，對冰草幼苗的生長也均表現為抑制作用。何俊瑜等研究結果發現，鎘處理對小麥種子萌發有抑制效應，且隨著鎘濃度的增加而增加[28]。這主要是離子濃度設置不同以及種子自身特性和環境不同的影響。重金屬污染較輕時，反而會提高某些植物的發芽率[29]。因此，在重金屬污染的土地上首先要明確各類重金屬含量的高低，然后要明確所種植的耐重金屬的草種對重金屬的敏感性，繼而選擇相應的草種。

本試驗發現在鎘溶液濃度為0.02%時顯著提高鴨茅幼苗POD的活性，對鴨茅幼苗中MDA的含量無顯著作用。鄭愛珍等研究結果表明，青菜中過氧化物酶的活性隨鎘濃度的增加而增加[30]，樊明琴等研究結果表明，小麥幼苗中過氧化物酶的活性隨著鎘濃度的增加總體呈增加趨勢，先緩慢增加后急劇增加[31]，陳維等研究發現抽穗期的稗草隨著鎘濃度的增加MDA含量先降低后升高[32]。很多研究都表明在鎘溶液的某一濃度會促進某種植物幼苗POD的活性或降低MDA的含量。因此，在保證提高種子發芽率的重金屬濃度范圍下，進而找到促進種子幼苗POD活性和降低MDA含量的重金屬濃度對獲得高產、抗逆的植株是至關重要的。

3.3 鎘脅迫下超聲波對發芽率、胚芽生長以及鴨茅POD活性、MDA含量的影響

本試驗研究表明：在五種不同濃度的鎘脅迫下，超聲波10 min的處理均可促進鴨茅種子的發芽率。當沒有鎘脅迫時，超聲波5 min對鴨茅種子的發芽率顯著促進，因此，在鎘脅迫下，超聲波時間在一定范圍內相應的增大才會促進鴨茅種子的發芽率。對于冰草而言，在鎘溶液濃度為0.05%時，各超聲波處理均顯著促進冰草種子的發芽率。有研究發現超聲波與某一物質的交互作用下對植物的發芽率并不是促進作用，如董匯澤等發現超聲波處理時間較長時，赤霉素對柴胡種子萌發有一定的抑制作用[33]。史鋒厚等研究中發現超聲波處理時間較長時聚乙二醇對油松種子的萌發有抑制作用[34]。因此，在重金屬污染的土壤上種植某種植物，選擇相應時長的超聲波處理尤為重要。

對于鴨茅種子而言，當鎘溶液的濃度較小為0.01%時，不同時長的超聲波處理均顯著促進鴨茅幼苗的生長，不同濃度鎘處理下各超聲波對冰草種子的胚芽生長無顯著作用。當鎘溶液的濃度較小為0.01%時，較小時長的超聲波5 min處理鴨茅種子可以提高其幼苗中POD的活性。李妹娟研究結果表明[35]：超聲波處理可以提高鹽脅迫下水稻幼苗中POD的活性。在不同濃度的鎘溶液脅迫下，較長時間的超聲波處理(>10 min)可以相對減少鴨茅幼苗中MDA的含量。因此，在重金屬鎘含量超標的土壤上，可各超聲波處理均顯著促進冰草種子的發芽率以種植用10 min的超聲波處理過的鴨茅種子，來提高鴨茅種子的發芽率以及對重金屬鎘的抗性。

3.4 鎘和超聲波的交互作用

對于鴨茅種子來說可以在超聲波時長為5 min和鎘溶液的濃度為0.02%時處理以使得發芽率和胚芽的共同促進。對于冰草種子而言，超聲波和鎘的交互作用對發芽率和胚芽生長各不相同。在重金屬污染的土地上，尋找到處理所用種子特定的超聲波時長，使得超聲波和重金屬的交互作用對種子發芽率和胚芽生長都有促進作用，以此提高種子出苗率、促進種子生長發育。因此，超聲波處理可以有效減緩鴨茅和冰草種子的鎘脅迫效應，提高種子和成苗活力。

4 結論

超聲波與鎘溶液組合處理的交互作用顯示，在較低鎘溶液濃度(0.01%)時，超聲波顯著促進鴨茅胚芽生長。在較高的鎘濃度(0.05%)脅迫下，超聲波處理10 min顯著提高鴨茅和冰草種子的發芽率；綜合來看，在生產實踐中，利用超聲波處理可以有效減緩鴨茅和冰草種子的鎘脅迫效應，提高種子和成苗活力。