地下滴灌條件下不同接種處理對苜蓿根瘤菌的定殖、結瘤和固氮的影響

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(1.新疆農業大學農學院，新疆 烏魯木齊 830052； 2. 新疆自治區高校農林有害生物監測與安全防控重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830052； 3. 新疆農業大學草業與環境科學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

西北干旱、半干旱區是我國苜蓿集中種植區，面積占全國種植面積的78.5%[1]。苜蓿是一種高耗水作物，水資源短缺、栽培粗放、生產水平低，嚴重制約了苜蓿生產的規模與效益。傳統苜蓿栽培采用大水漫灌，不僅地面蒸發損失嚴重，還造成植株受淹后根系呼吸受阻，不定根減少，直接影響根瘤菌的侵染結瘤和固氮效率[2-3]。地下滴灌是通過鋪設于地下的毛管將水分擴散到根系層供作物吸收的新興、高效節水的微灌技術，近年來開始應用于苜蓿生產中。試驗證明在干旱區苜蓿生產中地下滴灌能提高水分利用率，增產效果顯著[4-5]。

研究表明，接種優良根瘤菌能促進苜蓿早結瘤、多結瘤，增加固氮量，是降低氮肥投入，促進苜蓿高產穩產，提質增效的重要舉措[6]。根據不同地域的氣候環境特點和生產模式，篩選相匹配的優良菌株，建立適宜的接種技術，促進根瘤菌在土壤繁殖存活、穩定定殖和高效結瘤是發揮其固氮功能的關鍵。地下滴灌模式下的苜蓿生產，改變了灌溉制度和施肥管理措施，由此引發土壤水分分布格局、運移規律[7]，苜蓿生長性狀和根系分布特征發生改變[8]，必然會對根瘤菌的存活定殖、競爭結瘤和固氮功能產生影響，將直接關系到根瘤菌的接種效果。目前，對根瘤菌的應用研究多集中在常規灌溉模式下, 對地下滴灌條件下苜蓿接種根瘤菌的定殖、結瘤和固氮功能的研究少見報道。

本研究在前期工作中已篩選獲得固氮活性高、抗逆性能強的優良苜蓿根瘤菌菌株的基礎上，采用綠色熒光蛋白報告基因(GFP)標記菌株，原位研究在地下滴灌條件下，不同接種處理的根瘤菌在苜蓿根際的存活定殖、結瘤動態和固氮性能，為構建苜蓿根瘤菌應用技術體系，充分發揮根瘤菌的高效固氮功能，促進干旱區苜蓿產業的高產、優質和高效提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗于2015年在呼圖壁縣種牛場新疆農業大學草地生態試驗站進行。試驗站位于呼圖壁河右岸沖洪積扇緣與沖積平原交錯地帶，地理位置44°15′ N，86°55′ E，海拔439～454 m，年降水量155.2 mm，年蒸發量2 300 mm，冬季有積雪，生長季(4～9月)平均氣溫18.5℃，無霜期165～190 d。小區試驗地為耕種多年的農田，土壤為輕度鹽漬化灰鈣土。前茬作物為蘇丹草，灌溉方式為地下滴灌。

1.2 根瘤菌菌株

苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)XGL026菌株，是課題組在前期研究中從新疆紫花苜蓿根瘤中分離、篩選出的固氮活性高、抗逆性強、具有促生性能的苜蓿根瘤菌株。S.melilotiXGL026-GFP菌株：課題組前期研究中采用三親本雜交法對供試XGL026菌株進行GFP基因的標記，構建出的遺傳性能穩定、在熒光顯微鏡下發出明亮的綠色熒光、兼具四環素抗性(Tetr10 μg·mL-1)，對苜蓿的共生結瘤、生長性狀無明顯影響的標記功能菌株。

1.3 供試苜蓿品種

‘新牧一號’紫花苜蓿，由新疆農業大學草業與環境科學學院提供。

1.4 培養基及營養液

根瘤菌培養采用YMA培養基[9]。苜蓿沙培培養采用無氮營養液(g·L-1)[9]：MgSO40.49 g；KH2PO40.5 g；MnCl20.001 g；H3BO30.001 g；ZnSO40.001 g；鉬酸鈉0.001 g；CuSO40.0001 g；Na2Fe EDTA 0.02 g；蒸餾水1 000 mL。

1.5 試驗設計

試驗在苜蓿打草試驗地進行。地下滴灌系統為苜蓿建植當年鋪設，采用主管+支管+毛管系統，主管道直徑90 mm，支管道直徑63 mm，毛管為迷宮式，直徑12.5 mm，毛管鋪設行距60 cm，埋管深度10 cm。以地下井水為水源，滴頭標定流量1.38 L·h-1。苜蓿于2015年4月22日播種，行距30 cm，播種量4.5 kg·hm-2，不施化肥，播后灌出苗水。接種根瘤菌試驗共設7個處理(表1)。采用完全隨機區組設計，每處理3次重復，共21個小區。小區面積25.9 m2(3.7 m×7 m)。每茬苜蓿均于返青期、分枝期和現蕾期共滴灌3次，每次滴水時間24 h，10月23日冬灌。分別于2015年7月3日、8月17日和10月11日，苜蓿現蕾期刈割3次。常規田間管理，適時澆水，除草等。

表1 地下滴灌苜蓿接種根瘤菌的小區試驗處理Table 1 Plots trial treatments of inoculation rhizobium in alfalfa field under subsurface drip irrigation

1.6 根瘤菌接種液

活化根瘤菌菌種，接種至YMA(含10 μg·mL-1四環素)液體培養基中，120 r·min-1，28℃搖瓶培養至菌液OD600nm值為0.8～1.0，測定活菌濃度為2.0×109個·mL-1。

1.7 參比植物和無氮沙培試驗

在苜蓿田間小區試驗行間種植黑麥草(Loliumperenne)作為不固氮的參比植物[10]。

無氮沙培試驗：用于測定在無土壤因素影響下苜蓿植株15N同位素豐度。將河沙反復清洗、干燥后裝入營養缽(直徑：20 cm，高：30 cm)內。種子經表面消毒后，28℃催芽，待主根長出2～3 cm，側根未長出時，用菌液浸種15 min后植栽入盛有河沙的營養缽中。苜蓿生長期間定期澆灌無氮營養液(300 mL·營養缽-1)，同時以無菌水培養液浸種的處理作對照。

1.8 測定項目與方法

1.8.1根瘤菌在苜蓿根際土壤的定殖 分別在苜蓿不同茬次、不同生育期各處理小區連根完整挖取10～15株苜蓿植株，收集根際土樣，稱重。土樣放入裝有無菌玻璃珠的三角瓶中震蕩10 min，10倍稀釋，取合適濃度稀釋液涂布于四環素抗性平板，熒光顯微鏡下計數發光菌落數。

1.8.2結瘤數，主、側根根瘤分布及標記根瘤占瘤率 分別在苜蓿不同茬次、不同生育期，每小區每次連根完整取出10～15株苗，調查總根瘤數，主、側根根瘤數及發光根瘤數。采集的根瘤經表面滅菌后，用無菌鑷子壓破根瘤制備菌懸液，在含抗生素的YMA平板上劃線分離，28℃培養2～3 d，熒光顯微鏡下統計熒光菌落。

1.8.3苜蓿植株生物固氮率和固氮量 根瘤菌固氮率采用15N自然豐度法測定[11]。植株收獲后，75℃烘干、粉碎。莖葉15N%測定采用測量精度為0.001%的精密同位素質譜儀，全氮含量測定采用凱氏定氮法。計算不同處理的根瘤菌固氮百分率、固氮量。

根瘤菌固氮百分率(%Ndfa)通過下式計算：

%Ndfa=(δ15Ns-δ15Nf)/(δ15Ns-δ15Na)×100%

(1)

其中δ15Ns為參比植物(本試驗中為與苜蓿生長在同一試驗小區的黑麥草)的15N豐度，δ15Nf為試驗小區苜蓿的15N豐度，δ15Na為生長于無氮沙培上苜蓿的15N豐度。

根瘤菌固氮量用下式計算：

Ndfa=%Ndfa×Mlb×Cnc

(2)

Ndfa為單位面積根瘤菌的生物固氮量(kg·hm-2)，%Ndfa為根瘤菌生物固氮所占比例，Mlb為單位面積苜蓿生物量(kg·hm-2)，Cnc為苜蓿植株全氮含量(kg·kg-1)。

1.9 數據分析

運用SPSS Statistics 19.0軟件進行數據統計分析，并采用 Duncan檢驗進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同接種處理根瘤菌在苜蓿根際土壤的定殖動態

在不同茬次、不同生育期分別對各接種處理苜蓿根際土壤中S.melilotiXGL026-GFP的定殖數量進行測定，結果如圖1所示。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿苗期根際土壤中根瘤菌的定殖數量最高(1.02×104±0.165 cfu·g-1干土)，到分枝期數量急劇下降(減少41.18%)，至現蕾期數量基本維持穩定；第2茬苜蓿根際根瘤菌的定殖量較第1茬下降25.00%～34.92%；第3茬定殖量基本穩定在2.30×103±0.315 cfu·g-1干土。第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(D)處理，根瘤菌在根際土壤中的定殖數量顯著高于B處理(>1000倍)，且定殖菌量隨生長期的延長逐漸增加，至第3茬依然持續升高，保持較高的定殖量。拌種結合第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(B+D1)，第2茬苜蓿根際根瘤菌定殖量高于D處理。拌種結合第1、2茬苜蓿刈割后滴施2次根瘤菌(B+D2)，第3茬苜蓿根際土壤中根瘤菌的定殖量顯著高于B+D1處理(P<0.01)。拌種結合滴施根瘤菌并加施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)處理較不施氮肥(B+D1，B+D2)的處理，苜蓿根際土壤中根瘤菌的定殖量略有差異，但差異不顯著。

圖1 不同接種處理根瘤菌在苜蓿根際定殖動態Fig.1 Colonization dynamics of S.meliloti XGL026-GFP strain in the rhizosphere of alfalfa under different inoculation treatments注：CK-對照；B-拌種根瘤菌；D-追施根瘤菌；B+D1-拌種+滴施1次根瘤菌；B+D1+N1-拌種+滴施1次根瘤菌+施氮肥1次；B+D2-拌種+滴施2次根瘤菌；B+D2+N2-拌種+滴施2次根瘤菌+施氮肥2次，下同Note: CK means control group; B means soaking seeds with rhizobia; D means drip irrigation rhizobia; B+D1 means soaking seeds and drip irrigation rhizobia once; B+D1+N1 means soaking seeds and drip irrigation rhizobia once and nitrogenous fertilizer once; B+D2 means soaking seeds and drip irrigation rhizobia twice; B+D2+N2 means soaking seeds and drip irrigation rhizobia twice and nitrogenous fertilizer twice, the same as below

2.2 不同接種處理對苜蓿結瘤數的影響

統計各處理苜蓿的單株結瘤數(圖2)，結果顯示，與對照相比，各接種根瘤菌的處理均能有效增加苜蓿結瘤數。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿結瘤數從苗期至現蕾期迅速增加，至現蕾期時達到最高(33±0.005個·株-1)，較對照組增加13個·株-1。第2茬苜蓿的平均結瘤數依次為：B+D1+N1(34±2.118個·株-1)>B(28±0.032個·株-1)>B+D1(27±0.005個·株-1)>D(23±0.120個·株-1)>CK(17±0.218個·株-1)，各接菌處理均能顯著增加苜蓿結瘤數(P<0.05)，較對照增加6～17個·株-1(平均11個·株-1)，其中B+D1+N1處理的增幅最大。第3茬苜蓿結瘤數依次為：B+D2+N2(33±0.580個·株-1)>B+D1+N1(31±2.212個·株-1)>B+D2(30±0.223個·株-1)>B+D1(26±0.012個·株-1)>B(23±1.123個·株-1)>D(22±0.605個·株-1)>CK(16±0.045個·株-1)，接菌處理較對照組增加6～17個·株-1(平均12個·株-1)，其中B+D2+N2的增幅最大。

圖2 不同接種處理苜蓿單株結瘤數Fig.2 Nodule number of alfalfa under different inoculation treatments

2.3 不同接種處理標記根瘤菌的競爭占瘤率

采集各接種處理的苜蓿根瘤，抗性平板分離根瘤菌,檢測標記熒光菌落數，統計接種菌株的占瘤率。圖3顯示，各接種處理，1～3茬苜蓿上接種菌株S.melilotiXGL026-GFP的平均占瘤率達52.91%～76.71%，顯著高于土著根瘤菌，具有較強的田間競爭結瘤能力。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿根部根瘤菌的占瘤率逐漸上升(苗期34.50±0.577%～現蕾期47.22±0.334%)，到第2茬分枝期迅速上升至最大(67.30±1.339%)，在之后的生長期中基本維持該水平。D、B+D1和B+D1+N1處理，根瘤菌在第2、3茬苜蓿根部的占瘤率均逐漸上升，第2茬(分枝期)至第3茬(苗期)分別為46.6±1.220%～55.97±0.188%、66.70±0.415%～68.70±0.577%和69.50±1.322%～72.17±3.756%，其中B+D1+N1處理的占瘤率最高且持續穩定。B+D2及B+D2+N2處理，第3茬苜蓿上接種根瘤菌的占瘤率分別為67.57±0.368%和76.71±0.883%，B+D2+N2處理占瘤率更高，可見滴施接菌并加施少量氮肥對根瘤菌的占瘤率具有一定的促進作用。

圖3 不同接種處理對標記根瘤菌占瘤率的影響Fig.3 The labeled nodule occupancy of alfalfa under different treatments

2.4 不同接種處理苜蓿主、側根根瘤分布

對各處理苜蓿主、側根根瘤的分布情況進行統計，結果如圖4所示。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿從苗期到現蕾期主根根瘤占總根瘤數的比例由86.05±0.263%下降至40.16±3.352%，側根上形成根瘤比例由13.95±0.541%上升59.84±0.595%，較未接種對照平均增加5.68%。第2、3茬苜蓿的根瘤主要分布在側根上，接種處理側根根瘤比例分別為55.31±1.764%～71.00±0.263%(平均63.19±0.985%)、89.91±0.882%～91.25±0.887%(平均90.77±0.884%)，較對照增加0.09%～15.44%，以滴施處理的第2茬苜蓿的增幅最明顯。結果說明地下滴灌條件下接種根瘤菌，能明顯增加苜蓿新生側根和毛根數量，有利于根瘤菌侵染，增加側根根瘤分布。

圖4 不同接種處理苜蓿主、側根根瘤分布Fig.4 The nodule number in main, lateral root of different treatments

2.5 不同接種處理對生物固氮率、固氮量的影響

各處理的3茬苜蓿刈割后，分別測定根瘤菌的固氮率和固氮量(表2)。由圖可知，與對照組(CK)相比，接種優良根瘤菌菌株能顯著提高3茬苜蓿的固氮率和固氮量。播前拌種根瘤菌(B)，第1、2、3茬苜蓿根際根瘤菌的生物固氮率和固氮量較對照分別增加了40.41%、16.06%、11.10%和56.19 kg·hm-2、44.66 kg·hm-2、43.56 kg·hm-2，以第1茬苜蓿根際根瘤菌的固氮率、固氮量的增幅最大。第2茬苜蓿，各處理根瘤菌的固氮率和固氮量的大小依次為：B+D1+N1>B+D1>B>D>CK，接種處理的固氮率和固氮量較對照分別提高了3.35%～30.15%，26.17～72.83 kg·hm-2，以B+D1+N1的增幅最大，其次是B+D1的處理。第3茬苜蓿，各處理根瘤菌的固氮率的大小依次是：B+D1+N1>B+D2>B+D2+N2>B+D1>D>B>CK，固氮量的大小依次為B+D2+N2>B+D2>B+D1+N1>B+D1>D>B>CK，各接種處理根瘤菌的固氮率和固氮量較對照分別提高了11.01%～35.86%，13.56～83.86 kg·hm-2，其中B+D1+N1、B+D2和B+D2+N2處理根瘤菌的固氮率都保持較高，達到了75%以上，B+D2+N2處理的固氮量最高，固氮效應最為突出。

表2 不同接種處理苜蓿的生物固氮率和固氮量Table 2 The proportion of N fixed and the amount by alfalfa under different treatments

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

Note: Different small letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level

3 討論與結論

3.1 不同接種處理對根瘤菌在苜蓿根際定殖和結瘤的影響

3.1.1不同接種處理根瘤菌的根際定殖量 接種根瘤菌種群定殖動態受多種因素的影響，涉及接種方法、土壤非生物因素和生物因素的制約[12-13]。地下滴灌下的苜蓿生產模式改變了土壤環境，必然對接種根瘤菌的生存定殖、侵染結瘤和固氮功能產生影響[14]。利用基因標記技術標記根瘤菌株，依據標記基因作用于特異性底物產生的顏色反應或發光現象區別于土著菌，能直觀地原位示蹤、檢測功能菌株的環境行為[15-16]。本研究利用綠色熒光蛋白基因(GFP)作為報告基因，對前期研究中分離篩選出的優良根瘤菌菌株XGL026進行分子標記，通過地下滴灌田間小區試驗，示蹤、檢測不同接種處理對根瘤菌在苜蓿根際定殖和競爭結瘤性能的影響。結果顯示，不同接種處理根瘤菌的定殖動態和水平差異顯著。播前拌種根瘤菌(B)，在第1茬苜蓿苗期根際定殖密度最大，至第2茬苜蓿定殖密度下降，第3茬苜蓿僅有少量存留。第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(D)，拌種結合第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(B+D1)，拌種結合第1、2茬苜蓿刈割后滴施2次根瘤菌(B+D2)和拌種結合滴施同時增施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)處理，根瘤菌的定殖數量顯著高于B處理，在第2、3茬定殖數量持續升高，保持較高的定殖量。

3.1.2不同接種處理對結瘤數、占瘤率的影響 接種根瘤菌在根際存活、定殖是發生在根瘤菌侵染和建立共生關系的最初階段，對于成功與土著菌競爭占據根系，提高結瘤率至關重要。本研究表明，接種能顯著增加苜蓿結瘤數。B處理在第1茬苜蓿上的結瘤量最多，第2、3茬苜蓿上的結瘤數減少。而B+D1+N1處理第2、3茬苜蓿的結瘤數、占瘤率都明顯高于拌種(B)、滴施(D)和拌種結合滴施(B+D1、B+D2)處理。B+D2+N2第3茬苜蓿的結瘤數、接種菌占瘤率均達到最高，明顯優于其他處理。

李友國[17]等發現，接種根瘤菌在豆科植物根際的定殖水平與苜蓿結瘤量和固氮效應密切相關。但也有研究發現結瘤數量、占瘤率高的菌株并不與其在根際的定殖水平呈正相關[18]。本研究結果顯示，第1茬刈割后滴施1次根瘤菌(D)較播前拌種(B)能顯著提高根瘤菌在苜蓿根際的定殖量，但結瘤數和占瘤率均低于B處理。分析其原因，可能與苜蓿根系是根瘤的載體，接種根瘤菌結瘤量與根系發育密切相關。播前拌種處理(B)促進了苜蓿根系生長，根系活力顯著增加，有利于根瘤菌的侵染結瘤。而D處理是在第1茬苜蓿刈割后才接菌，盡管根瘤菌定殖量大，但苜蓿根系發育狀況劣于B處理，影響了根瘤菌共生結瘤。

播前拌種是目前根瘤菌應用中最主要的接種方式。此方式由于根瘤菌的遷移速度遠遠慢于根系的生長速度，造成根瘤菌與根系的接觸時間短，侵染結瘤率降低，影響接種效果[19]。實踐中發現，隨著苜蓿種植年限延長、刈割茬次增加，毛根減少、根皮老化，根瘤菌難于侵染、根瘤數會急劇減少，由此帶來的氮素供應缺乏，苜蓿產量、品質下降是苜蓿生產中的突出問題，能否通過補充接種根瘤菌提高其固氮能力也是當前需要解決的技術難題。本研究結果表明，苜蓿地下滴灌栽培模式下，采用常規的播前拌種接種根瘤菌(B)，在頭茬苜蓿根際定殖密度、結瘤數和占瘤率最高，但在第2、3茬苜蓿上則明顯降低。拌種結合在第1、2茬苜蓿刈割后滴施根瘤菌(B+D1，B+D2)和拌種結合滴施并增施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)處理能顯著增加2、3茬苜蓿根際根瘤菌的定殖密度、結瘤數和占瘤率(P<0.05)，其中B+D1+N1和B+D2+N2處理的接種效應最為突出。利用地下滴灌的地下毛管在灌水的同時將菌劑滴施到根區土壤中，可實現菌劑的可控、均勻和靶向施入，為不同種植年限、不同茬次的根瘤菌接種提供了新的途徑。

3.2 地下滴灌對根瘤在苜蓿主、側根分布的影響

姚新春等[20]的試驗顯示，隨著苜蓿生長期延長，主根皮層細胞不斷衰老而變厚，根瘤菌不易侵染形成根瘤，轉而去侵染幼嫩的側根和不斷更新的毛根，導致側根根瘤比例不斷增加，而主根上根瘤的比例持續下降。本試驗結果也顯示出相似的特點。苜蓿地下滴灌種植模式下，隨著生長期推移和刈割茬次的增加，根瘤的形成不斷向側根轉移，主、側根根瘤比例分布呈現明顯變化。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿苗期以主根根瘤為主，至現蕾期側根根瘤比例上升為優勢。在第2、3茬苜蓿各接種處理側根根瘤比例繼續上升。刈割會使側根在淺層土壤中的集中分布愈加明顯, 可能是2、3茬苜蓿側根根瘤比例增加的重要原因。另一可能的原因是地下滴灌條件改善了較淺土層的水分條件，能促進苜蓿新生側根形成、增加根毛和活根量；距滴灌滴頭越近毛根量越大[21]，使接種根瘤菌易于定殖和侵染，從而提高根瘤在側根上所占的比例。地下滴灌條件下，苜蓿根系的空間分布與根瘤菌侵染結瘤的動態變化規律還有待繼續深入研究。

3.3 不同接種處理對不同茬次苜蓿固氮效率的影響

3.3.1不同接種處理下的固氮效率 本試驗結果表明，地下滴灌苜蓿接種優良根瘤菌菌株能顯著提高固氮率，增加固氮量，不同接種處理、不同茬次苜蓿的固氮效率存在較大差異。采用拌種、滴施、拌種結合滴施、拌種結合滴施并加施少量氮肥等接種處理，在一個生長期的3茬苜蓿上的固氮百分率為54.52%～76.80%，較未接種對照提高了3.35%～40.41%；固氮量為43.00～183.39 kg·hm-2，較對照增加13.56～83.86 kg·hm-2。播前拌種(B)處理對第1茬苜蓿的固氮效應最突出，之后明顯下降。第2茬苜蓿上， B+D1+N1處理根瘤菌的固氮率和固氮量增幅最為顯著。在第3茬苜蓿上，B+D1+N1、B+D2和B+D2+N2處理都有較高的固氮率，其中B+D2+N2處理的固氮量增加最大。結果證明，在播前拌種基礎上，在2、3 茬苜蓿上配合滴施根瘤菌1～2次，并配施少量氮肥能顯著提高固氮效率，改善植株的氮素營養，促進苜蓿生長，提高了地上部干物質積累，達到了顯著的增產效果(另文報道)。

3.3.2根瘤菌接種和氮肥配施

氮素是影響根瘤菌固氮能力的重要限制因子，其影響非常復雜。氮肥施用量、氮肥類型、施用時期和方式等都會影響到根瘤菌的固氮效能[22]。Liu等[23]的研究發現豆科作物在返青期根瘤較少或在刈割后苜蓿的光合作用較弱時，根瘤菌尚未與其建立起有效的共生關系，得不到充足的碳水化合物，導致固氮作用較弱，苜蓿生長主要依靠吸收土壤氮素。此時期加施少量氮肥作為“起爆氮”能促進植株生長，增加結瘤和固氮。但氮肥供應過多，會影響根瘤菌對根毛的侵染，對固氮效率表現出明顯的抑制作用[24]。因此，在苜蓿生產中協調好充分發揮根瘤菌固氮作用和經濟有效地施用氮肥這一矛盾是一個值得研究解決的問題。

本研究結果表明，B+D1+N1、B+D2+N2處理，在第1、2茬苜蓿刈割后滴施根瘤菌同時加施少量氮肥(30 kg·hm-2尿素)1～2次，促進了苜蓿根系發育，有利于苗期返青生長，增加地上部光合產物向地下部分輸導，進而有利于根瘤菌的侵染、結瘤，起到顯著提高苜蓿固氮效率的作用。B+D2+N2較B+D1+N1處理增加了施菌和施氮肥的次數，在第3茬苜蓿上獲得了最高的固氮效應，體現出累加效應。有研究發現，土壤中根瘤菌群體的“載菌量”有一定閾值，增加接菌量提高接種效果的作用有限；同時增加接菌、施氮肥次數會增加生產成本。因此，根瘤菌施用次數和施菌量、加施氮肥的次數，氮肥施用量和施用時期等都還有待進一步優化，以期實現最佳生產效益。本研究結果對滴灌苜蓿栽培生產中應用根瘤菌和氮肥的高效利用，建立高產、優質、高效的苜蓿生產體系具有重要的實踐意義。