脫脂椰麩谷蛋白-1抗氧化性的研究

郭帥，李艷

（1.晉中學院，山西榆次030619；2.山西師范大學食品學院，山西臨汾041004；3.中國熱帶農業科學院椰子研究所，海南文昌571339）

現代醫學證明人體的許多疾病與體內自由基的失衡密切相關[1-2]。機體內過量的羥基自由基、超氧根離子自由基可進一步引發多種化學反應，生成一系列化學物質，從而使人體自由基失衡，最終導致各種疾病的發生[3]。同時，自由基引發的氧化-還原反應失衡也是導致食品品質下降、腐敗變質的重要因素。因而，控制機體內過量自由基的產生十分關鍵?？寡趸瘎┦悄軌蛴行宄杂苫奈镔|，在食品工業中的應用非常廣泛。目前常用的抗氧化劑多為化學合成類抗氧化劑，但因安全性問題其使用量和使用范圍受到越來越嚴格的限制。因此，尋找安全、高效、無毒的天然抗氧化劑成為研究的熱點。谷蛋白-1（glutelin-1）是蛋白質家族中較為特殊的一員，它是溶解于稀酸溶液中的一類蛋白質的總稱[4]。大多數植物蛋白質的等電點為pH3.0～5.0，在等電點附近，大多數植物蛋白溶液的靜電荷為零，溶解度最低；而谷蛋白-1的等電點較高，在此pH范圍內的溶解度較好，因而在食品工業尤其是酸性食品中有潛在的用途。前期的研究表明，椰子蛋白中含14.4%的谷蛋白-1，脫脂椰麩谷蛋白-1能夠有效降低小鼠的血清膽固醇，具有抗氧化的潛力[5-6]。椰麩（coconut cake）是椰肉榨汁后的副產物，含有8%～16%的蛋白質，是豐富的植物蛋白質資源[7]。然而，目前椰麩僅僅被用作動物飼料或蛋糕等食品的輔料，蛋白質等活性成分沒有被開發利用，造成了資源的極大浪費。本試驗以脫脂椰麩為原料制備谷蛋白-1，研究脫脂椰麩谷蛋白-1的抗氧化性，以期為椰麩的開發利用提供理論基礎和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰麩：南椰食品科技有限公司；三氯乙酸、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸鈉、冰乙酸、三氯化鐵：天津科密歐公司；2，2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、Ferrozine試劑、沒食子酸：Sigma公司。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發儀（IFFM-E）：香港BUCHI公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（PYX-DHG-9101-25A）：廣東韶關科力實驗儀器有限公司；磁力攪拌器（JB-3）：上海智光儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1200）：北京普析通用儀器有限責任公司；型臺式高速冷凍離心機（D-78532）：德國Httch公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂椰麩的制備

椰麩→50℃、鼓風干燥箱中干燥4 h→粉碎→過60目篩→加入石油醚（料液比=1∶10，g/mL）→振蕩脫脂2 h→過濾→棄濾液→重復脫脂3～4次→脫脂椰麩

1.3.2 脫脂椰麩谷蛋白-1的制備

參照Kwon等[8]的方法，50 g脫脂椰麩中加入300 mL、0.4 mol/L NaCl，4℃下攪拌提取 8 h，棄去過濾，收集濾渣。在濾渣中再次加入300 mL、0.4 mol/L NaCl，如此重復提取3次，棄去濾液，以除去椰子清蛋白和球蛋白。收集濾渣，加入50%冰乙酸，4℃下攪拌提取8 h，重復提取3次，合并提取液。然后在4℃、10 000 g下離心30 min，收集上清液，裝入截留分子量為4 000 Da的透析膜中，4℃下、在dH2O中透析24 h，每隔2小時換一次dH2O，將透析液冷凍干燥后即得到脫脂椰麩谷蛋白-1（defatted coconut cake glutelin-1，DCCG-1）。脫脂椰麩中蛋白質含量用微量凱氏定氮儀法測定（N×6.25），而提取液中蛋白質含量按照Bradford法[9]進行。

1.3.3 氨基酸組成分析

參照Wang等[10]的方法，在0.1 g DCCG-1中加入5 mL、6 mol/L的鹽酸中，110℃下水解24 h。用0.45 μm的膜過濾水解液，收集濾液，在HITACHI L-8900型氨基酸自動分析儀上測定。

1.3.4 DCCG-1對超氧根離子自由基的清除作用

將按照1.2.2制備的DCCG-1復溶于0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液（pH2.0）中，分別配制成50 μg/mL～250 μg/mL的溶液，用于抗氧化試驗。

參照文獻[11]的方法：取DCCG-1溶液0.1 mL，加入到3 mL、3 mmol/L的鄰苯三酚溶液中，混合均勻后，在320 nm下比色，每隔30秒記錄一次吸光值，共記錄10 min。模型管用dH2O代替樣品，以BHT做對照。

超氧根離子的清除率/%=（1-A樣品/A模型）×100

式中：A樣品為樣品管的吸光值，A模型為模型管的吸光值。

1.3.5 對ABTS+·的清除作用

參照文獻[12]的方法：將20 μL DCCG-1溶液與2 mL ABTS溶液（7 mmol/L）混合均勻，30℃下暗反應6 min，然后在734 nm下比色。模型管用dH2O代替樣品，以BHT做對照。

式中：A樣品為樣品（或對照）管的吸光值，A空白為空白管的吸光值。

1.3.6 對羥基自由基的清除作用

參照文獻[13]的方法：在1.34 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH7.4）中依次加入28 mmo1/L的脫氧核糖溶液0.3 mL，28 mmol/L的雙氧水0.3 mL，2.5 mmol/L的三氯化鐵溶液30 μL，l mmol/L的EDTA-Na20.3 mL以及0.1 mL、100 μg/mL的DCCG-1溶液。然后添加30 μL、10 mmol/L 抗壞血酸引發反應，37℃水浴 1 h，加入0.3 mL硫代巴比妥酸溶液（1%），30 μL三氯乙酸（28%），100℃，水浴20 min，冷卻后532 nm下測吸光值。模型管用dH2O代替樣品。以BHT作對照。

羥基自由基的清除率/%=（1-A樣品/A模型）×100

式中：A樣品為樣品（或對照）管的吸光值，A模型為模型管的吸光值。

1.3.7 Fe2+絡合能力的測定

參照文獻[12]的方法：移取50 μL、不同濃度的DCCG-1 溶液（50 μg/mL～250 μg/mL）于試管中，加入1 mmol/L 的 FeSO4溶液 25 μL，5 mmol/L 的 Ferrozine試劑50 μL，室溫反應10 min后，用甲醇定容到3 mL，在562 nm下測吸光值。模型管用甲醇代替樣品，用BHT作對照。

式中：A樣品為樣品（或對照）管的吸光值，A模型為模型管的吸光值。

1.3.8 還原能力測定

參照文獻[14]的方法：移取200 μL的DCCG-1溶液于試管中，加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6），1 mL鐵氰化鉀溶液（1%），混合后于50℃水浴加熱20 min，然后加入10%的三氯乙酸1 mL，4 000 r/min常溫離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL dH2O以及400 μL三氯化鐵（1 g/L），混勻后在700 nm測吸光值，用BHT作對照。

1.4 數據處理

試驗采用鄧肯氏新復極差法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 氨基酸組成

DCCG-1的氨基酸組成與含量如表1所示。

表1 脫脂椰麩谷蛋白-1的氨基酸組成和含量Table 1 Composition and content of amino acid in DCCG-1 g/100 g蛋白質

從表1可以看出，DCCG-1含有16種氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸的含量都較高。8種必需氨基酸中，色氨酸的含量很低，為第一限制性氨基酸。但DCCG-1中亮氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸的含量以及必需氨基酸總和（total of essential amino acids，TEAA）均顯著高于FAO/WHO[15]的推薦值（12.7 g/100 g蛋白質），表明DCCG-1的氨基酸組成相對合理。值得注意的是，DCCG-1中精氨酸、芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）和支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸）的含量較高，但缺乏半胱氨酸。研究表明，蛋白質或多肽鏈中這幾類氨基酸的含量與蛋白質或多肽的抗氧化性密切相關[11-14，16]。例如，芳香族氨基酸中苯環上的酚羥基可以快速給出質子，有效清除自由基[14]；而含硫氨基酸中的二硫鍵或巰基與蛋白質的金屬離子絡合能力密切相關[13-14，17]。

2.2 DCCG-1的抗氧化能力

2.2.1 DCCG-1對超氧根離子自由基（O2-·）的清除能力

O2-·是機體受損或代謝失衡時最先產生的自由基之一。O2-·會引發一系列化學反應，產生更多的自由基，引發氧化反應的進一步發生，直至對機體細胞或器官造成損傷。因而O2-·既是機體氧化反應的產物，也是許多氧化反應的引發物和底物[12，18]。O2-·清除能力已經成為衡量抗氧化劑活性的重要指標之一。DCCG-1對超氧根離子自由基（O2-·）的清除能力見圖1。

圖1 DCCG-1對O2-·的清除能力Fig.1 Scavening activity of DCCG-1 on O2-·

結果表明，與BHT相比DCCG-1具有更高的O2-·清除能力，這可能與DCCG-1中大量的苯丙氨酸和酪氨酸有關（表1所示），苯丙氨酸和酪氨酸所含的酚羥基可以提供質子而作為還原劑，有效猝滅O2-·，從而阻止氧化反應的進一步發生[14]。同時，隨著濃度的提高，DCCG-1的清除能力也提高。

2.2.2 DCCG-1對ABTS+·的清除能力

ABTS+·被廣泛應用于測定抗氧化劑的總抗氧化能力了。圖2顯示了DCCG-1在不同濃度下對ABTS+·的清除能力。

圖2 DCCG-1對ABTS+·的清除能力Fig.2 Scavening activity of DCCG-1 on ABTS+·

結果表明，隨著DCCG-1濃度的升高，其ABTS+·清除能力也逐漸變大。且在被測的濃度范圍內，DCCG-1對ABTS+·的清除能力顯著大于BHT。這可能與其氨基酸組成有關。如表1所示，DCCG-1中精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及支鏈氨基酸的含量都較高，尤其是精氨酸。這些氨基酸所含的一些基團，如胍基、酚羥基、支鏈氨基等，均可以提供質子，有效清除過量的游離自由基，阻止氧化反應的發生。BHT是工業中最常用的抗氧化劑和自由基清除劑。本試驗的結果表明，DCCG-1具有較高的總抗氧化能力?？梢岳眠@一性質，將DCCG-1添加到肉湯、火腿等食品中，提高產品的貨架期。

2.2.3 DCCG-1對羥基自由基的清除能力

·OH是已知的活性氧中對生物體毒性最強的一種自由基，它可以通過多種反應破壞生物體的各種大分子，如蛋白質、脂肪和DNA，特別是維生素B1和鳥嘌呤核苷[18]，對生物體造成很大程度的損傷。DCCG-1對·OH的清除能力見圖3。

圖3 DCCG-1對·OH的清除能力Fig.3 Scavening activity of DCCG-1 on·OH

如圖3所示，隨著濃度的增大，DCCG-1對·OH的清除能力逐漸升高。DCCG-1的·OH清除能力要顯著低于BHT。然而，200 μg/mL的DCCG-1對·OH的清除能力（20.48%）要顯著高于油棕粕谷蛋白-1（12.14%）[13]和米糠蛋白的清除能力（7.42%）[16]，這表明DCCG-1具有一定的·OH清除能力。

2.4 DCCG-1對Fe2+的絡合能力

在生物體內，Fe2+不僅可催化脂質過氧化反應，還能與活性氧反應產生羥基自由基，從而破壞生物體的生物大分子，生物體的抗氧化劑能夠絡合二價鐵離子而降低其損害。DCCG-1對Fe2+的絡合能力見圖4。

圖4 DCCG-1對Fe2+的絡合能力Fig.4 Chelating ability of DCCG-1 on Fe2+

如圖4所示，在 50 μg/mL～250 μg/mL 的濃度范圍內，DCCG-1對Fe2+的絡合能力顯著低于BHT。這可能與其缺乏含硫氨基酸有關。研究表明，蛋白質中的巰基或二硫鍵可以有效絡合Pb2+、Fe2+、Cu2+等金屬離子，這類蛋白質既可以作為有效的抗氧化劑，也可以用作重金屬解毒劑[19]。

2.5 DCCG-1的還原力

DCCG-1的還原力見圖5。

圖5 DCCG-1的還原力Fig.5 Reducing power of DCCG-1

在700 nm下的吸光值越高，表明該抗氧化劑的還原力越高，抗氧化性越強。如圖5所示，DCCG-1的還原力顯著高于BHT，且隨濃度的增大DCCG-1的還原力也逐漸增強。

3 結論

本試驗結果表明，DCCG-1對超氧根離子自由基和ABTS+自由基具有較強的清除能力；同時表現出較高的還原力和一定的羥基自由基清除能力和Fe2+絡合能力，這表明DCCG-1具有較強的抗氧化性；同時，由于脫脂椰麩的產量巨大，來源豐富，價格低廉，DCCG-1的制備工藝也相對簡單，因而DCCG-1具有開發為天然抗氧化劑的潛力。然而，大分子蛋白無法進入血液循環中直接發揮抗氧化活性；一些大分子蛋白被攝入后，容易被人體胃腸道消化系統中的酶降解，或生成多個無生物活性的肽段，或生成生物活性更強的肽段。因此，DCCG-1在體內是否具有抗氧化活性，還需要進一步的研究。