海島棉GbPR10基因的克隆及其抗枯萎病表達分析

艾海提·艾合買提，姚正培，曲延英

(新疆農業大學農學院/農業生物重點實驗室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】目前廣泛種植的栽培棉中，海島棉(Gossypiumbarbadense)有著纖維長度、比強度、細度等方面優異于其它棉類[1]。棉花病害，尤其是枯萎病的蔓延嚴重地影響了海島棉產量和品質[2]?？菸〔≡噲D進入棉花植株時，棉花不僅以自身特異的組織結構抵抗侵染，而且通過侵染誘導刺激誘導的基因調控來緩慢病害。PR10蛋白是一種具有抗蛋白酶特性的病程相關蛋白(Pathogenesis-related proteins，PRs)[3]。PR10與其它PRs一樣由病原有關環境下誘導而調節植物正常生長發育?！厩叭搜芯窟M展】1970年Van Loon[4,5]等在感染煙草花葉病毒(TMV)的煙草中發現PRs蛋白后，17類PRs蛋白質[4]被發現了。在不同物種誘導表達和功能具有很大的差別[6]。研究報道，PR-1是提高病原菌誘導獲得性抗性標志蛋白[7]；PR-2是以葡聚糖為底物，編碼β-1、3-葡聚糖內切酶并分解病原菌細胞壁的蛋白；PR-3、PR-4、PR-8和PR-11均有幾丁質酶活性；PR-6是以蛋白酶抑制劑形式，防御微生物、昆蟲和線蟲的損害[8]；PR-15、PR-16具有超氧化物歧化酶活性參與抗性反應[9]；PR-17蛋白具有鋅-蛋白酶活性，還需要進一步功能研究[10]。PR10蛋白是不同于其他PR蛋白，唯一分布于細胞內，沒有信號肽，具有核糖核酸酶功能有關的P-Loop(G-X-G-G-X-G-X-X-K)和抗真菌有關的Bet-v1結構域[11]。除了病原菌外PR10蛋白家族被水楊酸、乙烯等激素[12,13]誘導表達，是一種植物生長發育調節、抗病中多方面起作用的多功能蛋白家族。研究[14]發現PR10與細胞程序化死亡有關蛋白LRR1(leucine-rich repeat protein)相互作用，LRR1有助于PR10蛋白的正調控作用，能夠提高PR10防御信號，能夠有效的降低黃單胞桿菌(X.campestrispvvesicatoria)和霜霉菌(Peronosclerosporasacchari)對植物的損害。張桂榮等[15]發現，從棉花品種Pima90-53的全長cDNA文庫篩選出來的PR10基因被黃萎病菌和ET、SA誘導顯著表達。陳酈俊等[16]從黃萎病侵染的海島棉根部克隆了一個GbPR10-1基因，并發現大腸桿菌表達的GbPR10-1蛋白在體外抑制黃萎病菌菌絲的擴展，黃萎病接菌的抗病和感病品種里GbPR10-1的表達量迅速增加。【本研究切入點】目前從海島棉分離的PR10基因較少，研究海島棉GbPR10基因，解析棉花抗枯萎病分子機制，培育抗病品種提高基因來源?！緮M解決的關鍵問題】克隆GbPR10基因，進行生物信息學分析，枯萎病、ET、SA誘導下進行抗病表達分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用9份海島棉(Gossypiumbarbadenselinn)材料由新疆農業大學農學院遺傳系提供，其中6份抗病、3份感病品種[17]。材料種植和枯萎病接菌按水培和根系侵泡法[18]進行。由于一些比較復雜的病原菌侵染和相關傳導信號的交換發生在12～40 h[19]，采取40 h枯萎病接菌和0 h的9份棉花材料根、莖、葉等組織后超低溫保存待用。激素處理參照韓澤剛等[20]的方法：將抗病品種06-146和感病品種新海14號幼苗浸泡在乙烯(1 mmol/L)和水楊酸(50 μmol/L)處理，并分別在0、2、4、8、16和24 h時采取根組織，超低溫保存待用。表1

1.2 方 法

1.2.1 提取總RNA及反轉錄合成cDNA

按RNAplant Plus Reagent(TIANGEN)植物總RNA提取試劑盒說明書進行提取9份品種根、莖、葉片和“06-146”、新海14號兩種品種根部的總RNA，電泳檢測并測OD值。使用TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN)普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化RNA。按Maxima H Minus Firt Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFishir)試劑盒說明書進行合成反轉錄DNA。表1

表1 海島棉品種名稱、抗病性和來源地
Table 1 The name,pathogen sensitivity and source of sea-island cotton

編號Number品種名稱Name枯萎病抗性Disease sensitivity來源Resources106-146抗病中國新疆2埃棉2號抗病 埃及35917抗病前蘇聯4Dj-07-136抗病中國新疆5Pimas-7抗病 美國6Pima3-79 抗病 美國7新海14號感病中國新疆8埃及棉2號感病 埃及9海92-3 感病中國內地

1.2.2 目的基因克隆

根據前期轉錄組測序和抗病表達數據[18]，從棉花EST數據庫篩選出抗枯萎病有關的登錄號為CD486053基因cDNA序列，在NCBI搜索與該基因同源性為94%的海島棉抗病相關PR10基因(AY588276)，用該序列的編碼框設計引物GbPR10-F/R，從枯萎病接菌40 h根組織提取并反轉錄得到的“06-146”海島棉cDNA為模板，Transgen公司的PCR試劑進行擴增目標片段，擴增體系為25 μL：cDNA 1 μL、Buffer(含Mg2+)2.5 μL、dNTPs 2 μL、Taq酶1 μL、上下引物個1 μL，無菌水16.5 μL；擴增程序：94℃預變形4 min、94℃變形40 s，56℃退火30 s、72℃延伸30 s，34個循環，72 ℃再延伸7 min，保存4℃。擴增產物用1%凝膠檢測后成像儀拍照片，回收純化目的條帶，在PCR儀20℃下，15 min連接到pEASY-T1(Transgen)克隆載體上,轉化大腸桿菌感受態，涂布于固體LB(含卡那霉素)平板上，挑取單菌落于內有卡那霉素的液體LB培養基，在搖床180～200 r/min轉速12～14 h培養后進行菌落PCR，將與目的基因一致的樣品送華大基因公司測序。表2

1.2.3 生物信息學

將測序得到的序列與原序列在DNAMAN軟件里進行比對。使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線程序計算海島棉GbPR10基因編碼蛋白的理化參數。使用EMBL的InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)及ExPASy的PROSITE(http://prosite.expasy.org/)對推導出的GbPR10蛋白的功能結構域進行預測。在NCBI找到與該基因同源性高的不同生物序列并在DNAMAN里進行同源比對分析。用MEGA4.0軟件構件基因進化樹。用Prot Comp-Version9.0(http://linux1．softberry．com/)在線軟件對該蛋白質的亞細胞定位進行分析。

1.2.4 qPCR

根據GbPR10基因的ORF序列在Pimer3v.0.4.0(http//Frodo.wi.mit.edu/)軟件設計熒光定量PCR引物qGbPR10-F/R，以GhUBQ7-F/R為內參引物。利用TransStart Top Green qPCR SuperMix(Transgen)試劑盒進行該基因對不同海島棉的抗病性表達。qPCR體系為20 μL：cDNA模板2.5 μL、2Top Green qPCR SuperMix緩沖液10 μL、Passive Reference Dye校正溶液0.4 μL，Forward/Reverse引物個1 μL、6.3 μL無RNA酶水。實驗要用專用PCR板子，進行在ABI 7500 Fast 熒光定量PCR儀(ABI公司)，使用兩步法程序：94℃、30 s，94℃、5 s，60℃、30 s，總共40個循環，每個模板樣品為3次重復。采用2-△△Ct=2—[(Ct目的基因-Ct內參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組]進行表達分析。表2

表2 引物序列
Table 2 Primer sequences

名稱Name序列Sequences產物長度Product length (bp)使用UseGbPR10-FATGGGTGTTGCGAGTTATGbPR10-RGCTTGTATCTTTAGTTGC480目的片段克隆qGbPR10-FTGTTGAGCTCGAAGGTGATGqGbPR10-RAGCTGCCACAAACTGGTTCT199qPCR片段克隆GhUBQ-FGACCTACACCAAGCCCAAGAAGGhUBQ-RTGAGCCCACACTTACCACAATAGT189qPCR片段克隆

2 結果與分析

2.1 目的基因克隆及其蛋白質

以“06-146”海島棉枯萎病40 h處理的cDNA為模板，根據引物GbPR10-F/R(表1)進行RT-PCR擴增，得到480 bp長度的目的基因編碼框序列(圖1),在DNAMAN翻譯推到159個氨基酸序列(圖2)；分子量為17 300.62，預測的分子式為C786H1 203N189O240S5，等電點為4.83，該蛋白中含量多的氨基酸是Ala(17個，10.7%)、Glu(14個、8.8%)、Ser(13個，8.2%)，帶正電荷總體殘基(Arg+Lys)為21個，帶負電荷總體殘基(Asp+Glu)為13個。親水性平均數為-0.057，為親水蛋白；用NCBI SmartBlast結構域預測表明，該蛋白具有致病相關的Bet-v1功能區和核酸酶活性有關改變的甘氨酸環P-Loop(GXASXG)。二級結構分析表明(圖3-a)，該蛋白有2個α螺旋，其中一個位置在C端，另一個接近于N端的β-折疊，6個β-折疊散布在中間，說明該蛋白屬于PR10蛋白家族，三級結構進一步顯示(圖3-b)該蛋白與其他PR10蛋白相似性高。圖1～3

注：M.Marker；1、2.GbPR10產物

Note: M.Marker；1、2.GbPR10 Products

圖1 GbPR10擴增
Fig.1 Electrophresis of PCRproduct GbPR10

2.2 GbPR10蛋白質同源性及進化樹

經過NCBI搜索與GbPR10相似性高的其他物種蛋白序列，并在DNAMAN里進行同源。

研究表明，GbPR10與可可樹(Theobroma cacao，EOY06619.1)、葡萄(Vitis vinifera，CAN79558.1)、石榴(Punica granatum，OWM71176.1)、甜櫻桃(Prunus avium，XP_021806242.1)、歐洲山毛櫸(Fagus sylvatica，ACJ23865.1)、橡膠樹(Hevea brasiliensis，XP_021637260.1)、棗(Ziziphus jujuba，AGL07712.1)等植物同源性為79%、59%、56%、54%、55%、52%。比對顯示，GbPR10蛋白質甘氨酸環中間的兩個GG改變為AS，與Bet-v1結構域一致的序列都覆蓋為黑。圖4

通過MEGA4.0軟件對GbPR10蛋白及其它物種進行構建進化樹，研究表明，該進化樹分為2個大組，GbPR10與陸地棉(GossypiumhirsutumAAG18454.1)親緣關系最近，與雷蒙德氏棉(GossypiumraimondiiKJB84222.1)、異常棉(GossypiumarboretumKHG17625.1)分布在一個分支上，與除棉花外其它生物在不同大組上。圖5

2.3 GbPR10蛋白亞細胞定位

經ProtComp Version 9.0在線軟件對GbPR10蛋白預測表示，該蛋白位于細胞質的可能性86.2%，在細胞核內的可能性非常低(0.3%)，在其他細胞器里分布可能性13.5%，在細胞外沒有可能性，表明該蛋白在細胞質發揮作用。

2.4 GbPR10在不同抗病、感病及其不同組織的表達

GbPR10基因在枯萎病40 h誘導的不同海島棉品種不同組織上的表達量有明顯的差異并不均勻，在不同海島棉品種根上的表達量看出，除了抗病棉花Dj-07-136和5917出現較高的表達量上調趨勢外，其它抗病、感病品種表達量很低并沒有顯著差異；在不同品種莖上的表達量看出，抗病品種06-146、5917的表達量顯著高于其它抗/感品種，抗病品種埃棉2號也出現明顯的表達趨勢，而且其它品種的表達量很低并彼此之間無表達差異；在不同品種葉片上的表達量看出，每個抗病品種幾乎出現高表達趨勢，其中抗病品種埃棉2號、5917、Pimas-7的表達量最高，感病品種新海14號的表達量顯著高于其它兩個感病品種埃及棉24號、海92-3和抗病品種Dj-07-0136。

GbPR10在抗病品種的不同組織上出現較高而不均勻的表達量，但是感病品種幾乎沒有表達趨勢。圖6

圖2 GbPR10核算序列和氨基酸序列

Fig.2GbPR10nucleicacidandaminoacidsequences

圖3 GbPR10蛋白質二級結構(a)和三級結構(b)
Fig.3 GbPR10 Protein secondery structure(a)and 3D structure(b)

TcPR10：可可樹Theobromacacao(EOY06619.1)；VvPR10：葡萄Vitisvinifera(CAN79558.1)；PgPR10：石榴Punicagranatum(OWM71176.1)；PaPR10：甜櫻桃Prunusavium(XP-021806242.1)；HbPR10：橡膠樹Heveabrasiliensis(XP-021637260.1)；ZjPR10：棗Ziziphusjujube(AGL07712.1)；方框表示P-Loop；下劃線表示Bet-v1結構域核心序列； The Activation-Loop is boxed；Bet-v1 conserved domain is underlined

圖4 GbPR10與其他物種同源比對
Fig.4 GbPR10 homologous analyses with other plants

2.5 GbPR10基因在乙烯和水楊酸誘導下表達

乙烯處理后，GbPR10在抗病海島棉品種06-146表達出現先增后降的趨勢，8 h時表達量顯著高于其它時期；在感病品種新海14號的表達量不均勻，2、4和8 h時都表達量下調并低于處理前期(0 h)，16 h時表達量升高并達到最高值，之后緩慢下降。GbPR10在不同時期抗病品種的表達量顯著高于感病品種。

在水楊酸的誘導下，GbPR10在抗病品種06-146被誘導2 h時沒有表達，4 h時誘導后才出現表達量逐漸升高緩慢下降的趨勢；在感病品種新海14號中，雖然處理后期出現表達量趨勢，但是全處理時期的表達量都低于處理前(0 h)的表達量。每個時期抗病品種的表達量顯著高于感病品種。圖7

表3 GbPR10亞細胞定位預測
Table 3 GbPR10 Subcellular localization analyses

蛋白質擴散部位Protein located position可能性(%)Probability細胞質86.2細胞核1.9葉綠體0.3液泡0.7細胞膜0.7線粒體6.7內質網3.3細胞外0.0過氧化物酶體0.0高爾基體0.0

圖5 GbPR10與其他植物相關蛋白系統進化樹
Fig.5 Phylogenetic analyses of GbPR10 protein with other diffiren plants

注：不同小字母表示不同組織間顯著差異，不同大字母表示不同品種間顯著差異，均在0.05水平差異顯著

Note：Different small letters in The same coloum indicate significant difference between tissues, Different big letters in The same space indicate significant difference between varieties,all equally described in 0.05 level

圖6 GbPR10基因在枯萎病接菌不同海島棉品種根、莖、葉片中表達
Fig.6 GbPR10 expression in Fusarium oxysporum disposed Root、Stem and leaf of diffiren sea-island cotton

注：不同小字母表示不同品種間顯著差異，不同大字母表示不同時期間顯著差異，均在0.05水平差異顯著

Note：Different small letters in The same coloum indicate significant difference between varieties, Different big letters in The same space indicate significant difference between times,all equally described in 0.05 level

圖7 GbPR10基因在激素處理的海島棉根中表達
Fig.7 GbPR10 expression in hormone disposed Root of sea-island cotton

3 討 論

Markovic等研究證明，大部分PR10基因ORF序列約456～489 bp，推倒的氨基酸約為151～162個，分子量約在15～18 kDa，是一種分布于細胞質的酸性蛋白[21]。研究克隆的GbPR10具有480 bp編碼框序列，翻譯成159個氨基酸，分子量為17 300.62，存在于細胞質的親水性蛋白，此結果與前人的研究結果一致。Zhou等[22]發現棉花GaPR10蛋白的P-Loop中的氨基酸Glu-148和Tyr-150被替換后，其P-Loop活性幾乎喪失。但研究發現[23]刺茄SsPR10蛋白中，Glu97、Glu149和His151改變后并未喪失活性，分析認為該蛋白中Asp76、Gly111和Gly112可能替代形成了這一結構。研究的GbPR10蛋白活性環P-Loop(G-X-G-G-X-G-X-X-K)變為G-X-A-S-X-G-X-X-K，這與陳酈俊[16]克隆的海島棉PR10-1蛋白有相似性，但是這對該蛋白表達有無影響還需要進一步的研究分析。

作為病程相關蛋白的一個成員，PR10參與不同外源病原菌的誘導表達[24]。Park等研究發現，由辣椒疫霉菌誘導后辣椒CaPR10基因的表達量明顯的升高。Chadha等[25]發現原核表達的花生AhPR10融合蛋白具有抗F.oxysporum(尖鐮孢菌)和R.solan(紋枯病菌)菌活性。雖然很多PR10蛋白都是在病原體侵染條件下表達，但研究表明PR10在營養組織中也可以組成型表達。研究枯萎病侵染的6份抗病和3份感病海島棉品種根、莖、葉上對新克隆的GbPR10進行熒光定量表達分析，結果顯示，GbPR10基因在不同抗病品種葉片上的表達量顯著高，在感病品種選擇性表達，而無論是抗病或者感病品種根和莖上幾乎沒有顯著性表達。研究發現[24]刺茄SsPR10存在組成性表達，當幼葉被TMV接種后，SsPR10在葉片中表達量最高，根，莖的表達量較低。又研究報道[26]玉米ZmPR-10和ZmPR-10.1在根上的表達量高于莖和葉片的表達量。說明GbPR10病原體誘導下也存在組成型表達，在不同品種和不同組織上的表達量有差異，抗、感品種表達量差異有可能與PR蛋白在抗病品種自身合成，感病品種與外源脅迫相互作用合成的特征有關系[27]。

植物激素在植物抗病途徑中的作用是很重要。Raskin等[28]證明SA是植物病程相關蛋白增強抗病性所必須的信號分子，提高植物系統獲得性抗性(Systemic Acquired Resistance，SAR)的前提，ET的誘導使植物體內產生一些小肽，并通過提高誘導系統抗性(Induced Systemic Resistance,ISR)抑制病原菌的危害[29]。研究通過ET和SA處理一對抗病和感病海島棉品種對GbPR10進行表達，表明ET誘導后在抗病品種出現先增后降的表達量趨勢，感病品種處理后期出現表達；SA誘導8 h達到最高表達量后逐漸下降，而感病品種幾乎沒有誘導表達。研究說明ET誘導GbPR10的表達，而感病品種的表達量比較晚；外源施加的SA提高GbPR10的表達量，而抗病品種對SA敏感性比感病品種高。這種激素誘導可能與GbPR10蛋白的氨基酸序列或者抗病、感病海島棉品種本身組織結構、抗病性有關，這需要進一步的研究。

研究推測海島棉GbPR10基因可能在枯萎病抗病途徑和相關信號途徑中發揮一定的作用。

4 結 論

從高抗病海島棉中克隆了GbPR10基因，通過生物信息學發現該蛋白含有突變的甘氨酸活性環G-X-A-S-X-G-X-X-K和特有的Bet-v1保守結構域，GbPR10蛋白與其他物種有高度的相似性，基因進化樹表明與陸地棉PR10蛋白親緣關系最近，在海島棉抗病、感病組織上不同程度地由枯萎病和ET、SA誘導表達，在海島棉生長過程中具有抗病性作用。