好要湯對雌性小鼠卵巢功能的影響

1.廣禾堂草本生物科技(上海)有限公司，上海 200030；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006

好要湯具有緩解勞累、促進產后恢復的功能，源于婦科臨床補腎強腰方，含覆盆子、黃精、玉竹、酸棗仁等中藥，具有益氣扶正、補肝腎的功效，可緩解體力疲勞，提高人體精力，預防早衰，促進人體各項功能恢復[1]。研究通過觀察給藥后對雌性小鼠的陰道角化上皮細胞、子宮和卵巢的體重及指數、孕酮P的含量、卵巢和子宮的形態學等方面的變化，考察好要湯的促排卵功效，為其科學合理運用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Honour Intrument Shaker歐諾搖床(天津市歐諾儀器儀表有限公司)；Top Pette8-Channer Pipettor移液排槍(大龍興創實驗儀器(北京)有限公司)；MNT-150美耐特原點數顯卡尺(上海美耐特實業有限公司)；OLYMPUS CKX41倒置式生物顯微鏡(北京中儀光科科技發展有限公司)；ELX800通用酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑 好要湯(批號：170521，廣禾堂草本科技(上海)有限公司)；定坤丹(批號：139170102，山西廣譽遠國藥有限公司)；孕酮P試劑盒(上海通蔚實業有限公司)；4%多聚甲醛固定液(批號：20160314，武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.3 動物 SPF級昆明種小鼠，雌雄兼用，體質量18～22 g，南方醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK(粵)2016-0041，廣東藥科大學實驗動物中心飼養實驗。

2 方法

2.1 分組及給藥 取雌性小鼠75只，隨機為5組，空白組，定坤丹組，好要湯低、中、高劑量組，適應性喂養5 d后，根據體重逐只給藥，連續給藥15 d。空白組灌胃生理鹽水，陽性組選用定坤丹，給藥量為臨床等效量(1.62 g/kg)，好要湯高劑量組(6.8 g/kg，臨床等效量的1.5倍)，好要湯中劑量組(4.5 g/kg，臨床等效量)，好要湯低劑量組(3 g/kg，臨床等效量的0.67倍)。

2.2 陰道角化上皮細胞檢查[1]于給藥第10 d后每日上午9時，各組小鼠每日陰道涂片1次。將無菌棉簽用生理鹽水浸濕后插入小鼠陰道，充分蘸取分泌物后取出，在玻片上輕輕滾動，使分泌物均勻地涂布于玻片上，自然風干，以新配制的5%美藍溶液(95%乙醇溶液配制)染色，2 h后用水漂去多余染色液，待干，置于生物顯微鏡下觀察陰道角化上皮細胞的情況，連續涂片1個動情周期(5 d)。以角化上皮細胞面積大于涂片總面積的50%作為陽性判斷標準，計算陽性率[2]。

2.3 血清中孕酮P水平檢測 末次給藥1 h后，各組小鼠均用摘眼球法取血，將所取血液靜置2 h后，離心(3000 r/min，10 min)，分離血清，按照試劑盒說明書操作。測定小鼠血清中孕酮P的含量。孕酮P酶聯免疫分析(ELISA)的具體操作步驟如下：①標準品的加樣：設置標準品孔和樣品孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL。②加樣：分別設置空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加帶測樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不要觸及孔壁，輕輕晃動混勻。③加酶：每孔用移液排槍加酶標試劑100 μL，除空白空外。④溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。⑤配液：用20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。⑥洗滌：小心揭開封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。⑦顯色：每孔先加顯色劑A 50 μL，再加顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。⑧終止:每孔加終止液50 μL，終止反應(此時藍色立即轉藍色)。⑨測定：以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD)值。測定應在加終止液后15 min內進行。⑩計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為橫坐標，繪制標準曲線，得出直線回歸方程式，根據樣品的OD值算出相應的濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度[3-4]。

2.4 子宮、卵巢指數測定末次給藥1 h后，摘眼球取血后迅速將小鼠處死，剖開腹腔，取出子宮和兩側卵巢，剝離周圍組織和脂肪，迅速以電子天平稱量子宮和卵巢的濕重。換算成臟器指數:子宮指數=子宮重量(mg) /100 g體重，卵巢指數=卵巢重量(mg) /100 g體重。

2.5 子宮和卵巢組織形態學檢查將所取的新鮮子宮和卵巢組織標本以4%多聚甲醛固定液固定，常規脫水，浸蠟包埋，切片，HE染色。生物學顯微鏡檢并攝像，觀察組織形態學變化，并記錄雙側卵巢切片中各級卵泡總數和黃體數目。

2.6 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 對陰道上角化細胞的影響 空白組小鼠在涂片的5 d內，動情前期、動情期、動情后期和動情間期的周期性變化比較明顯，可觀察到角化上皮細胞數量和白細胞數量呈反比的規律性變化。其余組表現為陰道脫落細胞性周期延長、不規則，在采樣時間內可觀察到陰道涂片上出現成片或團塊的角化上皮細胞，只有少量的白細胞。定坤丹組、好要湯中劑量組和高劑量組均能不同程度地延長雌性小鼠的動情期，角化上皮細胞大于50%的陽性率與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。定坤丹組和好要湯高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 好要湯HYT對陰道上角化細胞的影響

注：與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.2 對血清中孕酮P含量的影響 與空白組比較，好要湯組(3、4.5、6.8 g/kg)能不同程度地升高小鼠血清中孕酮P含量；好要湯高劑量組(6.8 g/kg)與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1、表2。

表2 好要湯HYT對孕酮P含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.3 對子宮和卵巢形態、臟器指數及各級卵泡總數的影響

3.3.1 對小鼠體重、臟器指數的影響 好要湯(3、4.5、6.8 g/kg)組與空白組比較，體重無明顯變化，子宮重量有所增加，子宮指數稍大，但差異均無統計學意義(P>0.05)；好要湯高劑量組與空白組比較，卵巢重量明顯增加，卵巢指數明顯增大，差異有統計學意義(P<0.01)。好要湯(3、4.5、6.8 g/kg)組與定坤丹組比較，小鼠體重、子宮重量、子宮指數均無統計學差異(P>0.05)；好要湯中、低劑量組與定坤丹組比較，卵巢重量偏小，卵巢指數偏低，差異有統計學意義(P<0.01)；好要湯高劑量組與定坤丹組比，兩者卵巢重量和卵巢指數均無統計學差異(P>0.05)，即高劑量的好要湯能增大小鼠的卵巢重量和卵巢指數。見表3。

表3 小鼠體重、子宮和卵巢重量及臟器指數的比較

注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.3.2 對子宮和卵巢形態的觀察 由子宮切片(見圖2)和卵巢切片(見圖3)可得，空白組子宮腔內膜上皮厚度較薄，腺腔輕度擴張，血管較少；卵巢體積稍小，色澤蒼白，卵泡結構不清，或囊泡呈原始狀態。卵巢皮質部可見不同發育階段的卵泡，可見少量黃體和白體形成，未見囊性卵泡，可見適量脂滴。好要湯(3、4.5、6.8 g/kg)組與空白組比較，子宮外觀粗大發紫，宮腔內膜上皮變厚，腺腔擴張，可見核下空泡，間質疏松；卵巢色澤更鮮艷，卵泡明顯增大，卵泡未見明顯的囊性擴張、細胞變形、壞死炎細胞浸潤等病變；髓質未見充血、水腫及炎細胞浸潤。表面見較多黃體，黃體的顆粒細胞發育良好，形態完整，排列整齊緊致[5]。

3.4 對卵巢中各級卵泡總數和黃體數目的影響 由表4可知，好要湯(3、4.5、6.8 g/kg)組與空白組相比，卵泡總數有明顯增加的趨勢，但兩者差異無統計學意義(P>0.05)；好要湯低劑量組、中劑量組與空白比較，黃體數目無統計學差異(P>0.05)，高劑量組(6.8 g/kg)與空白組比較，黃體數目明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各級卵泡總數和黃體數目的比較

注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

中醫認為，腎虛主要體現在腰膝酸痛、腿軟、耳鳴耳聾、齒發脫落、失眠多夢、潮熱盜汗、性功能減退、女子經少、經閉或卵巢早衰等方面，其癥狀與現代醫學理論中疲勞或慢性疲勞綜合征的癥狀基本一致，都是人生理機能衰退的表現[6-7]。因此，緩解體力疲勞、提高精力、養生保健及防止衰老等，都可從補養腎精腎氣入手調理[8]。傳統中醫藥重視調動人體自身的免疫力，達到抗疲勞能力，在對抗疲勞，提高精力，抗衰老方面有著得天獨厚的優勢，同時具有安全有效，毒副作用小的特點。因此，研發出具有毒副作用小、療效良好、可長期服用的中藥功能食品，將具有較大的市場發展潛力。

好要湯可延長雌性小鼠的動情期，明顯升高角化上皮細胞陽性率，增大小鼠的卵巢指數，提高孕酮P含量，明顯增加黃體數目，闡釋了好要湯方溫補腎陽的現代科學內涵[8]。