蜜蜂蜂毒皮下注射對家兔血小板聚集和粘附功能的影響

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1.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室/大理大學，云南 大理 671000；2.上海華匯拓醫(yī)藥科技有限公司，上海市 浦東新區(qū) 201203；3.藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心/大理大學，云南 大理 671000

腦血管疾病是全身性血管病變或系統(tǒng)性血管病在腦部的表現(xiàn)，是血管源性腦部病損的總稱，中醫(yī)稱“中風”，具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復發(fā)率高的特點，嚴重影響人們的健康以及社會經(jīng)濟的發(fā)展[1]。目前臨床上常用的預防和治療缺血性腦血管疾病的藥物有溶栓、抗凝和抗血小板聚集藥[2]，其中抗血小板治療是缺血性腦卒中二級預防的重要手段[3]。因此，低毒副作用、可長期使用的抗血小板聚集藥物的開發(fā)是當前防治腦血管疾病藥物研發(fā)的熱點之一。

動物毒素，如水蛭[4]、蚯蚓[5]、蛛毒[6]、蛇毒[7]，及昆蟲毒素[8-9]等具有明顯的抗血栓作用。蜜蜂蜂毒由蜜蜂的毒腺分泌并貯存于毒囊中，是一種成分復雜且藥理作用較多的無色芳香液體[10]，研究發(fā)現(xiàn)，其具有很強的抗凝血[11]及抗血栓[12]作用，能使血液凝固時間明顯延長。但是是否通過皮下注射蜜蜂蜂毒，研究蜜蜂蜂毒抗血小板聚集作用則未見相關(guān)報導。基于此，本課題以ADP二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate, ADP)、膠原(Collagen, COL)為誘導劑，研究蜜蜂蜂毒(BV)對家兔血小板聚集和粘附功能的影響，進一步探討B(tài)V作為防治心腦血管病抗栓的可能性。

1 實驗材料

1.1 動物 健康雄性家兔，體重2.0～2.5 kg，購于大理大學實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5周后用于正式實驗。實驗條件：清潔級，室溫16～22 ℃，相對濕度68%，12 h明暗交替照明，自由進食、飲水。

1.2 藥物和試劑 蜜蜂蜂毒(BV，批號：20160927，藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心)；枸櫞酸鈉(批號：1204261，四川西隴化工有限公司)；氯化鈉注射液(批號：C150120L，昆明南疆制藥有限公司)；二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP，批號：7-16-5366，Helena工廠)；膠原(Collagen，COL，批號：5-16-5368，Helena工廠)；氯吡咯雷(批號：20140929，深圳市麗晶生化科技有限公司)。

1.3 儀器 AggRAM血小板聚集儀(Helena Laboratories)；BSA124S微量電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；TCL16M臺式高速冷凍離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)；DHG-9240電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；VORTEX-5漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；SK8200H超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)的制備 參考文獻的方法[13]，將血液加入含有3.2%枸櫞酸鈉的離心管中，使3.2%枸櫞酸鈉和血液的容積之比為1∶9。將上述得到的抗凝血充分混勻后25 ℃下以100 g的離心力離心10 min后取上層血漿即為PRP。然后將剩余的血漿，25℃下以2000 g的離心力離心15 min后取上層血漿即為PPP。

2.2 血小板聚集實驗

2.2.1 實驗分組 取健康雄性家兔30只，根據(jù)體重均分為5組，分別為生理鹽水組(NS組)、氯吡格雷組(3.85 mg/kg·BW)、和BV 0.18、0.36、0.72 mg/kg·BW劑量組。其中，NS組為溶媒對照組、氯吡格雷組為陽性對照組[14]，氯吡格雷采用灌胃給藥,灌胃體積是2.5 mL/kg,BV組采用皮下注射,體積為2 mL。

2.2.2 實驗方法 各實驗組連續(xù)給藥5 d，每天上午給藥1次，末次給藥后1.5 h進行心臟取血，之后按照“2.1”的實驗方法制備PRP和PPP。采用比濁法測定血小板聚集率：取PPP 250 μL于比濁杯中，以含PPP杯為基準調(diào)零，在PRP杯中分別加入25 μL的ADP、COL，誘導血小板聚集，測定5 min內(nèi)血小板最大聚集率。其中，誘導劑ADP、COL的終濃度分別為6.07 μmol/L、3.03 μg/mL。抑制率的計算公式如下：

2.3 血小板粘附實驗 動物分組、各組劑量和給藥方法同“2.2.1”。各實驗組 連續(xù)給藥5 d，于末次給藥后1.5 h時立即對家兔進行心臟取血，制備PRP和PPP，參考實驗方法[15]加入35 μL的COL，在血小板聚集儀上進行溫育攪拌10 min，分別測定加入COL前后血小板的光密度(Optical density，OD)值。血小板粘附率的計算公式如下：

其中常數(shù)1.11系加膠原后PRP被稀釋的校正值。

2.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標準差表示，采用One-Way ANOVA(即單因素方差分析)，事后檢驗采用LSD(最小顯著性差異)法，方差不齊采用Tamhamne’s T2法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 血小板聚集實驗 BV低、中、高劑量連續(xù)注射5 d，開始家兔出現(xiàn)輕微呼吸加促的現(xiàn)象，第5天，家兔身體狀況無明顯變化，對家兔健康無不良影響。由表1可知，ADP誘導時，NS組的聚集率為(64.93±4.97)%。與NS組比較，氯吡格雷組、BV低、中、高劑量組均可以顯著降低ADP誘導的血小板聚集率：59.31%(P<0.05)、26.54%(P<0.05)、36.62%(P<0.05)、51.11%(P<0.05)，受試藥物各組呈量效依賴關(guān)系。由表2可知，COL誘導時，NS組聚集率(77.40±7.91)%。與NS組比較，氯吡格雷組和BV中、高劑量組的血小板聚集率都明顯降低(P<0.05)其中BV高劑量組抑制率達62.90%，基本和陽性藥相當。

組別劑量/mg/kg聚集率/%抑制率/%NS組- 64.93±4.97-氯吡格雷組3.8526.42±5.42**59.310.1847.70±3.18*26.54BV0.3643.10±13.21**36.620.7229.80±14.30**51.11

注：與NS 組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別劑量/mg/kg聚集率/%抑制率/%NS組-77.40±7.91 -氯吡格雷組3.8520.48±18.13**73.930.1862.60±13.0019.12BV0.3647.62±14.65**29.280.7228.72±13.34**62.90

注：與NS組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 血小板粘附實驗 由表3可知，與NS組比較，氯吡格雷組、BV中、高劑量組均能降低COL誘導的血小板粘附性(P<0.05)，粘附抑制率分別為47.36%、43.94%、49.36%，BV中、高劑量組效果基本和陽性藥相當。

組別劑量/mg/kg粘附率/%粘附抑制率/%NS組-79.25±7.53-氯吡格雷組3.8541.72±25.74*47.360.1868.95±4.7612.99BV0.3644.43±21.76*43.940.7240.13±28.01*49.36

注：與NS組比較，*P<0.05。

4 討論

血小板的活化和聚集是血栓形成的重要病理基礎(chǔ)。抗血小板藥物是通過抑制血小板的異常形變、粘附、聚集和釋放反應(yīng)以抑制血栓形成和動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展。因此抗血小板藥物是防治心、腦血管疾病的重要藥物。

血小板膜上有ADP、膠原、凝血酶等多種受體，任何一種受體被其誘導劑激活后，血小板表面即表達出纖維蛋白原受體(GPIIb-IIIa)，纖維蛋白原受體與纖維蛋白原結(jié)合，導致血小板聚集。不同的誘導劑使血小板活化聚集的能力也不同，如誘導能力強的凝血酶和COL可引發(fā)血小板內(nèi)各種顆粒內(nèi)容物的聚集；而誘導能力中等的花生四烯酸和血小板活化因子使血小板活化變形的能力不如上述的強誘導劑；誘導能力弱的5-HT和ADP則需要血小板分泌顆粒內(nèi)容物協(xié)助其作用，方可引發(fā)血小板不可逆的聚集反應(yīng)；誘導劑腎上腺素則只有在超過生理濃度下才能發(fā)揮作用[16]。ADP是引發(fā)血小板聚集的活性物質(zhì)，雖然它本身是弱誘導劑，但其能增強或放大其它誘導劑的作用，比如一些弱的誘導劑如腎上腺素或5-HT等化學激活劑。氯吡格雷為ADP受體阻斷劑，臨床一線抗栓藥物，本實驗選其為陽性藥。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蜜蜂蜂毒對ADP、COL誘導的家兔血小板聚集有較好的抑制作用。文獻中[17]也有報道小劑量蜂毒可抑制ADP所引起的血小板聚集，這與本實驗結(jié)果一致。

血小板粘附機制中有三種主要成分起作用：血小板膜糖蛋白、內(nèi)皮下組份和vWF。血管內(nèi)皮下基質(zhì)的主要成分是纖維狀I(lǐng)、III、VI型膠原、纖維連接蛋白和vWF等。當中最重要的是膠原，它既是經(jīng)常發(fā)生血小板粘附的部位，激發(fā)血小板變形活化的能力也強。血小板的表面有兩類主要的膠原受體：血小板GPVI和整合素α2β1(GPIa/IIa)，這兩種受體可以直接粘附于膠原。但是GPIb/XI/V復合物粘附于膠原的過需要vWF介導[18]。參與血小板粘附過程的血小板膜糖蛋白主要有GPIIb-IIIa和GPIb-IX，二者分別在血小板粘附過程的不同階段發(fā)揮作用，但都是vWF的受體。當GPIb-IX經(jīng)vWF的橋連介導作用與膠原發(fā)生接觸粘附時會致使血小板變形活化，同時GPIIb-IIIa的受體部位也會被暴露出來。GPIIb-IIIa之所以可以使血小板呈現(xiàn)伸展變形的粘附狀態(tài)，是因為其可以粘附于vWF、纖維蛋白原以及多種的粘附蛋白(如：纖維連接蛋白)。

文獻[19]多采用血小板粘附儀，利用血小板計數(shù)法計算粘附率，本研究參考文獻[15]采用血小板聚集儀測定富血小板血漿OD值的方法計算粘附率。實驗結(jié)果顯示對膠原和血小板接觸引起的粘附，陽性藥氯吡格雷有顯著地抑制作用，這與文獻[20-21]報道一致。BV中劑量和高劑量組對血小板粘附也有一定的抑制作用，與陽性藥比較差異無統(tǒng)計學意義。實驗室前期的大鼠動靜脈旁路實驗中，BV可以抑制血小板在絲線上的粘附，與本實驗結(jié)果一致。

綜上所述，本研究表明蜜蜂蜂毒對ADP、COL誘導的家兔血小板聚集有一定的抑制作用，其還可以抑制血小板在膠原表面的粘附。本實驗研究為進一步的抗腦缺血整體評價奠定基礎(chǔ)，為預防和治療心腦血管疾病提供一定的科學依據(jù)。