Diascie ProBact全自動微生物分離培養系統臨床應用評估

鄭 恬，徐修禮，白 露，周 柯，陳 瀟，郝曉柯

（第四軍醫大學西京醫院檢驗科，陜西 西安 710032）

隨著科技的發展，臨床基礎檢驗、免疫學、生物化學等檢測方法均已實現全自動化樣本前處理，而微生物檢驗卻一直延續傳統的手工劃線接種方式[1]。微生物全自動前處理系統在微生物檢驗的自動化中發揮了重要作用，既減少了差錯率，增加了生物安全，為樣本的接種提供了標準化的操作平臺，又減輕了檢驗人員工作強度，使其從重復、繁瑣的操作中解放出來，致力于檢驗后程序的質量控制，保證檢測結果準確和可靠[2-3]。目前，市場上的全自動微生物流水線幾乎均為國外公司生產，如意大利Copan公司的Copan Wasp全自動微生物前處理系統（簡稱Copan Wasp）、法國生物梅里埃公司的PREVI Isola系統及美國BD公司的Innova系統等[4-5]。第四軍醫大學西京醫院檢驗科于2014年在國內率先引進了Copan Wasp，通過自定義系統參數優化設置樣本處理方案，并接入實驗室信息系統，利用條形碼技術對樣本進行自動化接種劃線。目前，國產全自動微生物分離培養系統已研發成功，本研究就該儀器臨床標本分離培養效果與Copan Wasp及手工法進行比對，評估其在臨床中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 收集第四軍醫大學西京醫院各病區的痰樣本和中段尿樣本各50例。

1.1.2 儀器 國產Diascie ProBact全自動微生物分離培養系統（簡稱Diascie ProBact）由武漢迪艾斯科技公司生產，Copan Wasp由意大利Copan公司生產，VITEK MS質譜鑒定系統由法國生物梅里埃公司生產。

1.1.3 試劑 痰液消化劑Sputasol由英國Oxoid公司生產，無菌痰管Copan12及挑痰棒由意大利Copan公司生產，VITEK MS基質液及靶板由法國生物梅里埃公司生產，血平板、含萬古霉素巧克力平板和麥康凱平板由鄭州安圖公司生產，專用分離培養裝置由武漢迪艾斯科技公司生產。

1.2 方法

1.2.1 樣本的前處理及接種 （1）Diascie ProBact。該系統由自動化樣本預處理振蕩儀、專用分離培養裝置、自動化細菌分離培養儀組成。首先使用專用樣本采集杯采集樣本，放入樣本預處理樣本盤內，對痰液樣本進行振蕩消化預處理20 min，中段尿樣本不需特殊處理。然后將預處理后的樣本懸液轉移至專用分離培養裝置（裝置由培養基、培養基架、樣本池和1 μL接種環組成）內，根據不同樣本類型設置方案，選擇不同的培養基組合和劃線方式上機進行接種劃線及培養。本研究痰樣本接種選擇血平板、萬古霉素巧克力平板和麥康凱平板的培養基組合，中段尿樣本接種選擇血平板和麥康凱平板的培養基組合。（2）Copan Wasp。在Copan12無菌痰管中各加入1 mL提前配制好的10%溶痰劑，使用挑痰棒挑取痰樣本中可疑部分，放入已加溶痰劑的痰管中，常溫下放置10 min，隨后上機自動依據設置的方案進行接種劃線；中段尿樣本則需要倒入特定的尿杯中貼好條碼，再上機進行接種劃線。（3）手工法。該操作由同一位操作熟練的檢驗人員完成。痰樣本用痰消化液常溫下消化10 min，混勻后用無菌棉簽沾取，涂布于血平板第1區，再用1 μL接種環進行四區接種劃線，并以同樣方式接種于含萬古霉素的巧克力平板和麥康凱平板上。使用一次性1 μL接種環沾取尿液樣本，在血平板上以連續劃線方式進行接種劃線，以同樣的方式接種于麥康凱平板。嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）[6]進行操作。

1.2.2 細菌培養 （1）Diascie ProBact。該系統為接種與孵育一體化裝置，痰樣本孵育環境為35 ℃ 5% CO2孵育箱，中段尿樣本孵育環境為35 ℃普通孵育箱。（2）Copan Wasp。該系統連接有Copan WaspLab模塊的孵育和鏡像系統，承接通過軌道直接送入的接種好的平板。設置痰樣本孵育環境為35 ℃ 5% CO2孵育箱，中段尿樣本孵育環境為35 ℃普通孵育箱。（3）手工法。痰樣本消化接種后置35 ℃ 5%CO2孵育箱內進行孵育培養，而中段尿樣本置35 ℃普通孵育箱內孵育培養。

1.2.3 菌落鑒定 采用VITEK MS質譜鑒定系統對形成的菌落進行鑒定。

1.2.4 判讀標準 培養24 h后，中段尿樣本和痰樣本分別按定量方式與半定量方式進行判讀。痰樣本判斷標準為：一區＜10個菌落記為≤10×103cfu/mL；一區＞10個菌落且二區＜5個菌落記為100×103cfu/mL；一區＞10個菌落且二區＞5個菌落、三區＜5個菌落記為1 000×103cfu/mL；一區＞10個菌落且二區＞5個菌落、三區＞5個菌落記為≥10 000×103cfu/mL。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。收集50例痰樣本和50例中段尿樣本的分離菌種、細菌生長量及有效單個菌落的數據，并保存平板上菌落分離效果圖像。有效單個菌落以±s表示。采用多樣本χ2檢驗對3種接種劃線方法的不同菌落種屬數量、不同細菌生長量進行比較，采用單因素方差分析對3種不同方法的有效單個菌落數量進行比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分離菌種數量

2.1.1 痰樣本 Diascie ProBact接種后分離出0（無細菌生長）、1、2及≥3種菌的樣本分別為1、16、8和25例，Copan Wasp為1、14、10和25例，手工法為2、14、9和25例，3種方法之間比較，差異無統計學意義（P=0.987）。三者檢出有意義致病菌分別為21、20和19例。

2.1.2 中段尿樣本 Diascie ProBact接種后分離出0（無細菌生長）、1、2及≥3種菌的樣本分別為20、16、8和6例，Copan Wasp分別為18、17、9和6例，手工法分別為19、18、7和6例，3種方法之間比較，差異無統計學意義（P=0.998）。

2.2 細菌生長量

50例痰樣本及50例中段尿樣本3種接種方法的細菌生長量結果見表1和表2。在痰樣本和中段尿樣本中，3種方法之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 有效單個菌落

50例痰樣本及50例中段尿樣本不同方法間有效單個菌落統計結果見表3。3種方法間痰樣本和中段尿樣本的有效單個菌落數量差異均無統計學意義（P＞0.05），三者中以Copan Wasp為最多。平板分離效果見圖1和圖2。Diascie ProBact與Copan Wasp菌落分區生長明顯，單個菌落邊界清晰，而手工法菌落生長略顯密集，可能是手工用力不均所致。

3 討論

目前，在檢驗其他專業都普及全自動流水線的情況下，大部分實驗室的微生物檢驗仍采用傳統的手工方法對臨床微生物樣本進行接種劃線、培養、分離。然而手工方法因不同工作人員的手法、接種習慣和熟練程度不同，會對樣本的分離效果產生直接而明顯的影響，而且在樣本接種時常發生“張冠李戴”的情況，同時在生物安全方面也存在著一定的隱患。全自動微生物分離培養流水線系統的研制成功及其在臨床中的應用極大地改善了上述問題，可對樣本的劃線接種進行統一、規范的操作[7]，而且，由于全自動微生物流水線連接自動數字讀板系統，附帶條碼識別功能，增強了樣本的溯源性，避免了人為差錯和手工的繁瑣勞動，提高了樣本的接種效率和菌落分離效果，可減少再次分離次數，為臨床報告節省了時間，同時可實現微生物培養的實時監控，第一時間為臨床提供早期實驗室微生物檢測信息[8-9]。

表1 50例痰樣本不同方法的細菌生長量 （例）

表2 50例中段尿樣本不同方法的細菌生長量 （例）

表3 痰樣本和中段尿樣本不同方法有效單個菌落數量（±s）

表3 痰樣本和中段尿樣本不同方法有效單個菌落數量（±s）

樣本類型 Diascie ProBactCopan Wasp 手工法痰樣本 9.78±5.37 10.48±5.59 8.82±5.31中段尿樣本 8.78±4.38 9.74±4.49 7.33±5.03

圖1 痰樣本3種方法的分離效果

圖2 中段尿樣本3種方法的分離效果

本研究結果顯示，在痰樣本中，手工法無細菌生長2例，多于Diascie ProBact和Copan Wasp；檢出細菌19例，低于Copan Wasp的20例和Diascie ProBact的21例，這可能是由于痰樣本在前處理過程中Diascie ProBact及Copan Wasp均進行10～20 min的震蕩消化，使其充分液化，均質性高，使得細菌得以完全釋放，提高了培養陽性率，而手工接種法則是在常溫下無震蕩液化10 min，消化效果不及前二者，但總體比較，3種方法之間差異無統計學意義（P＞0.05），表明3種方法在痰樣本分離菌落種屬上性能基本一致，與文獻報道[10]有所不同。而在中段尿樣本中，Diascie ProBact無細菌生長20例，分別多于Copan Wasp的18例和手工法的19例，Diascie ProBact假性結果略高于后二者，其原因需進一步探討。

在細菌生長量方面，Diascie ProBact在痰樣本中分離出高濃度菌（≥10 000×103cfu/mL）33例，高于Copan Wasp的31例和手工法的27例。除了上述的可能原因之外，Diascie ProBact有接種與孵育一體化的裝置，在接種劃線完畢后無需轉移平板，直接于孵育箱中按設置的條件進行孵育。Copan Wasp雖然自動化程度高，接種劃線在儀器內完成，但平板仍需通過軌道運輸進入孵育箱，而手工法劃線后則需要人工將平板放入孵育箱，可能會對細菌培養產生一定的影響，尤其不利于苛氧菌的培養。然而，3種方法在痰樣本和中段尿樣本中的差異均無統計學意義（P＞0.05）。

本研究有效單個菌落生長情況及數量結果表明，手工法菌落生長相對集中且密集，分離度稍差。無論在痰樣本還是中段尿樣本中，Copan Wasp的有效單個菌落平均數量都最高，其次為Diascie ProBact，均優于手工法。提高有效單個菌落的分離數量，可以減少再次分離次數，以便盡早進入菌落鑒定及體外藥物敏感性試驗步驟，從而縮短報告時間[11-12]，盡快為臨床提供準確的診斷數據。

盡管Diascie ProBact較手工法具有一定的優勢，但仍然存在一些問題有待解決與完善：（1）痰樣本采用四區的連續劃線方式，從而導致從原區到第4區菌落數不是呈遞減分布，這也是其單個菌落分離數量雖優于手工法，但不及Copan Wasp的原因所在；（2）接種環外周與平板的接觸面積過大，導致接種樣本懸液量較多，對細菌生長量有一定影響，故其計數均大于Copan Wasp和手工法；（3）培養基的垂直放置培養，可導致樣本懸液沿平板流散，同樣可導致菌量增多；（4）缺少條形碼掃描系統，降低了樣本的溯源性，易引起人工差錯，增加出錯率。

綜上所述，國產Diascie ProBact體積小，占用空間小，費用經濟，主要性能指標優于手工法，預處理裝置可充分將痰液液化，勻質性好，提高了檢測陽性率和效率，縮短報告時間，實現微生物接種劃線的標準化、規范化，可替代手工法廣泛應用于臨床微生物實驗室。