MiRNAs作為膽管癌診斷標志物的Meta分析

金 巍，韓 濤，洪 欣，孫大軍，趙浩民

(吉林大學中日聯誼醫院血管外科，長春 130033)

膽管癌在肝膽系統腫瘤中發病率僅次于肝細胞癌，目前根治性切除術是其首要治療方法，但因早期缺乏有效的診斷方法，癥狀體征不明顯，大部分患者初次就診時腫瘤就已發生轉移而失去手術機會，預后差、病死率高，5年生存率僅5%～10%[1-2]。微RNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于真核生物的小分子RNA，其在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要調控作用。目前已有較多文獻報道，miRNAs對膽管癌的早期診斷具有潛在價值，但因多數研究樣本量較小且樣品的來源、檢測方法不同等而導致研究結果不完全一致。為此，采用Meta分析的方法，定量綜合統計，以全面客觀地評價miRNAs在膽管癌早期診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1檢索策略 系統全面地檢索了Pubmed、Web of Science、Cochrane Library、中國知網、萬方和維普等數據庫，檢索語言為中、英文，收集所有關于miRNA表達與膽管癌診斷相關的文獻，且不限制文獻發表時間。中文檢索關鍵詞為“膽管癌”“微小RNA”“microRNA”和“診斷”； 英文檢索詞為“cholangiocarcinoma” “microRNA” 和“diagnosis”。此外，為避免檢索不全面，手動檢索相關文章的參考文獻。

1.2文獻的納入和排除標準 納入標準：(1)文獻為原始研究；(2)研究內容涉及miRNA表達對膽管癌的診斷價值；(3)文中有充分的數據能夠直接或間接獲得miRNA診斷膽管癌的靈敏度和特異度；(4)當存在來自同一人群的研究時，選擇納入人群最多或時間最近的文章。排除標準：(1)綜述、會議報道、評論、動物實驗；(2)無法得到完整數據，不能構建診斷分析的2×2表格；(3)語言非中、英文。

1.3數據提取 根據事先制訂好的納入排除標準，兩名研究者各自獨立地篩選符合標準的相關文獻，若有分歧，則由第3位研究者評估后做出決斷。確定納入文獻后，兩名研究者各自獨立地分別從每一篇參考文獻中提取以下信息：第一作者姓名、文章發表年份、國家、種族、樣本類型、檢測方法、病例組和對照組的樣本量、靈敏度和特異度。

1.4質量評價 根據診斷試驗文獻質量評價標準的14個條目(QUADAS)[3]，對納入的每篇文獻進行質量評價。每個條目的評價標準均包含“是”“否”和“不清楚”。“是”表示達到此條目標準，記1分；“否”表示未達到此條目標準，不得分，記0分；“不清楚”表示無法從原文獻中獲得此條目足夠信息，記0.5分。

1.5統計學處理 本篇文章采用Meta-Disc 1.4和Stata 12.0軟件進行統計分析。作為診斷型的Meta分析，本文的評價指標有合并的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷比值比及其相應的95%置信區間，同時繪制合并受試者工作特征(SROC)曲線并計算曲線下面積(AUC)，AUC值越接近1，說明診斷的效能越高。納入的文獻中各研究間存在較大的異質性是Meta分析中較常見的問題，而異質性檢驗包括閾值效應和非閾值效應檢驗。通過繪制SROC曲線，以及計算靈敏度、1-特異度對數的Spearman相關系數來檢驗本研究是否存在閾值效應。若異質性是由非閾值效應引起的，則通過I2來評估異質性的大小，若I2>50%且P<0.05,認為各研究間存在較大的異質性，采用隨機效應模型進行統計分析并通過做亞組分析來探討異質性的來源。同時，通過做Deek′s 漏斗圖不對稱檢驗，來判斷和評估本研究是否存在發表偏倚。

2 結 果

2.1文獻檢索情況 初步檢索共篩出392篇文獻，其中在Pubmed數據庫檢索出161篇，在Web of Science數據庫檢索到129篇，在Cochrane Library檢出2篇，中國知網檢出29篇，萬方數據庫檢出44篇，維普數據庫檢索到27篇，合計392篇，復篩后共納入11篇文獻，其中英文9篇，中文2篇。文獻檢索流程見圖1。

圖1 文獻檢索流程圖

表1 納入文獻的基本信息和質量評價

2.2納入文獻的基本信息和質量評價 納入文獻的基本特征和質量評價結果見表1。11篇文獻共包括819例研究對象，其中病例組共439例，對照組共380例。

2.3發表偏倚評估 Deek′ s檢驗用于評估本研究是否存在發表偏倚，在本研究中，漏斗圖斜率系數為0.59，P=0.570，本篇Meta分析納入的文獻不存在發表偏倚，見圖2。

圖2 納入文獻的Deek′ s 漏斗圖

2.4閾值效應 本篇Meta分析通過繪制SROC曲線，以及計算靈敏度、1-特異度對數的Spearman相關系數來檢驗本研究是否存在閾值效應，SROC曲線不成肩臂狀分布；Spearman相關系數為-0.025，P=0.940，不存在閾值效應(圖3)。

圖3 MiRNAs 診斷膽管癌的 SROC曲線

2.5合并分析結果 初步合并靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比和診斷比值比，上述指標的I2值分別為49.6%、66.0%、60.1%、41.0%和40.1%，同時每項研究的估計值與合并效應值不呈同一條直線，納入本篇Meta分析的各研究間存在著非閾值效應引起的異質性，故采用隨機效應模型進行Meta分析。分析結果顯示miRNAs診斷膽管癌的靈敏度為0.86[95%CI(0.80,0.87)]，特異度為0.85[95%CI(0.81,0.89)],陽性似然比為4.83[95%CI(3.23,7.31)],陰性似然比為0.22[95%CI(0.16，0.29)]，診斷比值比為27.49[95%CI(15.30，49.38)]，見圖4～8。SROC曲線結果顯示，本研究的AUC值為0.908 2。

圖4 MiRNAs對膽管癌的診斷靈敏度森林圖

圖5 MiRNAs對膽管癌的診斷特異度森林圖

圖6 MiRNAs對膽管癌診斷的陽性似然比森林圖

圖7 MiRNAs對膽管癌診斷的陰性似然比森林圖

圖8 MiRNAs對膽管癌診斷比值比森林圖

2.6亞組分析 由于納入的研究間存在由非閾值效應引起的異質性，進一步按不同種族和標本類型進行分組做亞組分析。按種族分組，其中2篇文章[4,11]中的3個研究的實施地點和研究人群分別來自美國、德國，屬于白色人種(高加索人種)，其余9個研究[5-10,12-14]分別來自中國、日本和泰國，屬于黃色人種。采用隨機效應模型進行Meta分析，不同種族的各診斷指標合并值見表2。按標本類型分組，其中4個研究[8-9,11-12]的樣本來自血清，2個研究[13-14]的樣本來自血漿，1個研究[10]的樣本來自尿液，2個研究[5,11]的樣本來自膽汁，3個研究[4,6-7]的樣本是組織來源。采用隨機效應模型進行Meta分析，不同樣本類型的各診斷指標合并值見表2。

表2 亞組分析結果

3 討 論

膽管癌起病隱匿，惡性程度高，一旦發現多為中晚期，轉移早、手術切除率低，且預后差。糖蛋白抗原CA19-9是目前診斷膽管癌常用的血清學指標，但其特異性和靈敏度欠佳[8]。因此，如何早期發現、早期診斷和治療已成為膽管癌研究的重點。近些年來的研究發現，miRNA廣泛存在于正常人和患者的體液、組織中，且不同類型的腫瘤，miRNAs的表達譜亦有特異性變化[15]。目前，已有Meta分析系統研究了miRNAs對胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等的診斷價值，但尚無miRNAs對膽管癌診斷價值的Meta分析。本研究筆者全面系統地檢索相關文獻，采用Meta分析的方法評估了miRNAs對膽管癌的診斷價值。

本篇文章共納入9篇英文和2篇中文，膽管癌患者共439例，對照組共380例。經分析發現，miRNAs對膽管癌診斷的合并靈敏度和特異度分別為0.83[95%CI(0.80,0.87)]和0.85[95%CI(0.81,0.89)],合并后的診斷比值比為27.49[95%CI(15.30，49.38)]，AUC值為0.908 2，以上結果顯示miRNAs診斷膽管癌的靈敏度和特異度均大于0.80，且AUC值大于0.90，提示miRNAs作為膽管癌早期診斷的生物標志物具有較高的性能。經檢驗，本研究不存在閾值效應，但存在由非閾值效應引起的異質性，為進一步分析異質性來源，分別以種族和檢測樣本類型為分組依據，對納入的11篇文獻進行了亞組分析。亞組分析結果顯示，miRNAs對白種人膽管癌診斷的靈敏度為0.773，低于黃種人(0.845)，但特異度為0.927，高于黃種人(0.823)，診斷比值比為35.503,高于黃種人(26.318)，提示miRNAs檢測白種人膽管癌的早期診斷價值高于黃種人。樣本類型的亞組分析結果顯示，組織來源的診斷比值比最高，為89.595，提示miRNAs作為膽管癌的生物標志物時，組織的診斷價值優于血清(33.802)、血漿(29.956)、膽汁(25.340)，但在亞組分析結果中，組織來源的3個研究合并診斷比值比的I2高達81.8%，其他樣本來源的研究診斷比值比I2均為0，結果表明，在本研究中，由非閾值效應引起的異質性主要來源于以組織標本為研究對象的3篇文章[4,6-7]，提示組織中miRNAs檢測的穩定性較差。同時，考慮臨床操作的復雜性、有無創傷性和患者的痛苦程度，認為檢測人體血液標本中miRNAs的表達水平更具有實際意義。

本研究力求嚴謹、無誤，但仍存在以下不足和缺陷：(1) 由于語言限制，本研究檢索的文章僅限于中、英文，且納入的中文文獻僅2篇，雖然發表偏倚檢驗顯示本研究不存在發表偏倚，但由于能力有限，未檢索其他語言類型的文章，導致納入文獻尚不全面；(2)由于單個miRNA對膽管癌診斷價值的原始研究數量較少，本篇Meta分析納入的11篇文章中，miRNAs的類型較分散，不存在針對某個特異性的miRNA對膽管癌診斷價值的3個及3個以上研究，因而無法對某一個miRNA的診斷效能下結論，也就無法給出某個特定miRNA對膽管癌的診斷價值結果。因而進一步的大樣本研究和尋找某個特異性的miRNA將是未來研究的方向和重點。

綜上所述，miRNAs診斷膽管癌具有較高的靈敏度和特異度，其對白種人的診斷價值高于黃種人，就臨床意義而言，血液標本中的miRNAs在膽管癌的早期診斷方面更具臨床應用前景。