游泳和下坡跑通過CN/NFAT信號途徑對2型糖尿病小鼠骨吸收代謝的影響

陳祥和，李世昌，孫 朋，陳愛國，馬 濤，牟其林

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游泳和下坡跑通過CN/NFAT信號途徑對2型糖尿病小鼠骨吸收代謝的影響

陳祥和1，李世昌2，孫 朋2，陳愛國1，馬 濤3，牟其林4

1. 揚州大學 體育學院, 江蘇 揚州 225127; 2. 華東師范大學, 上海 200241 “青少年健康評價與運動干預”教育部重點實驗室 ; 3. 齊魯師范學院 體育學院, 山東 濟南 250200; 4. 貴陽學院 體育學院, 貴州 貴陽 550000.

目的：探究游泳和下坡跑通過鈣調磷酸酶(CN)/活化T細胞核因子(NFAT)途徑對T2DM小鼠骨吸收代謝的影響。方法：采用6周高脂膳食和一次性注射鏈脲佐菌素（STZ）進行T2DM造模，成功后隨機分為T2DM對照組(TC)、T2DM游泳組(TS)和T2DM下坡跑組(TD)，另選C57小鼠為正常對照組（ZC）。T2DM小鼠繼續高脂膳食，ZC小鼠飼以普通飼料。TS和TD小鼠分別進行8周游泳和下坡跑訓練。末次訓練24 h后處死小鼠并取材，應用Micro-CT、細胞原代培養、ELISA、RT-PCR及West-blotting等技術方法對骨組織形態計量學指標、OC數量、離子濃度、細胞因子mRNA和蛋白表達等進行檢測。結果：TC組股骨中TRAF6、CN、Src-3、PLC、NFATc1、TRAP mRNA及脛骨中Src1和NFATc1蛋白表達上調(＜0.05)，血清IP3和Ca2+濃度升高(＜0.05)，BMM分化產生的OC總數量和≥10個核OC數量增多(<0.01)。股骨遠端松質骨和皮質骨骨組織形態計量學指標顯著下降(＜0.05)。與TC比，TS組股骨中TRAF6、CN、PLC和TRAPmRNA及Src1蛋白表達下調，血清Ca2+濃度下降(＜0.05或＜0.01)。TD組股骨中TRAF6、CN、Src-3、PLC、NFATc1和TRAPmRNA及脛骨中Src1和NFATc1蛋白表達下調，血清IP3和Ca2+濃度下降(＜0.05)。OC總數量和≥10個核OC數量顯著減少（<0.05），松質骨和皮質骨骨組織形態計量學指標顯著改善(＜0.05)。與TS比，TD組股骨中TRAF6、Src-3、PLC和TRAP mRNA表達下調及血清IP3和Ca2+濃度下降(＜0.05)，OC總數量(＜0.05)下降，松質骨BS/TV增加(＜0.05)。結論：T2DM小鼠骨吸收增強。下坡跑通過抑制T2DM小鼠骨中CN/NFAT途徑，減少OC數量，降低骨吸收，改善骨組織形態結構，且其作用效果優于游泳。

運動；CN/NFAT；2型糖尿病；破骨細胞；骨吸收；骨組織形態計量學

2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus，T2DM）機體骨代謝發生紊亂，骨吸收大于骨形成，骨密度（Bone mineral density, BMD）降低、骨組織形態結構退化，導致骨質疏松發生[26]。T2DM小鼠松質骨的骨形成速率、骨小梁形態結構和生物力學性能顯著下降[15]。人體研究中，T2DM患者骨代謝紊亂，股骨頸等BMD降低，骨質疏松及骨折發生率顯著增加[19]。運動作為抑制骨吸收的有效干預方式，可顯著提高T2DM人或動物的BMD、骨組織形態結構、骨生物力學等骨表型指標，改善骨健康[7,13]。但運動方式不同對骨產生的力學刺激方式（分為直接力學刺激，即地面反作用力和間接力學刺激，即肌肉牽拉力）存在較大差異，直接力學刺激抑制骨吸收的作用效果優于間接力學刺激[1]。鈣調磷酸酶（Calcineurin, CN）/活化T細胞核因子（Nuclear factor of activated T cell, NFAT）是介導骨吸收的關鍵途徑[20]，其可調控OC分化產生、融核及其骨吸收能力。但有關運動影響該途徑進而調控T2DM骨吸收代謝的相關研究尚待探究。本研究擬利用游泳和下坡跑對T2DM小鼠進行干預，探究兩種運動方式對T2DM骨吸收代謝的影響及CN/NFAT信號途徑在此過程中的調控機制，為運動改善糖尿病骨健康提供科學依據。

1 研究材料與方法

1.1 實驗動物造模及分組

40只4周齡C57BL/6雄性小鼠購自上海西普爾—必凱公司（生產證號：SYXX（滬）2015-0011），初始體重19±0.24g，適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組（ZC，10只）和高脂飼料組（30只）。高脂飼料組小鼠喂飼高脂飼料（購自上海斯萊克公司，配方：繁殖鼠料54.6%、豬油16.9%、蔗糖14.0%、酪蛋白10.2%、預混料2.1%和麥芽糊精2.2%。其中碳水化合物、脂肪和蛋白質3大物質的供能百分比分別為40%、40%和20%。），6周末空腹12h后，利用注射器于小鼠下腹部離腹白線約0.5cm處刺入，針頭與小鼠腹部成30°角，一次性注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ, 80 mg/kg），ZC組注射檸檬酸/檸檬酸鈉溶液。2周后，利用Roche血糖儀(型號ACCU-CHECK?Active)和血糖試紙檢測小鼠空腹血糖濃度，≥8 mmol/L為T2DM小鼠[17]，共27只。隨機將T2DM小鼠分為T2DM對照組（TC，9只）、T2DM游泳組（TS，9只）和T2DM下坡跑組（TD，9只）。ZC組小鼠喂以普通飼料，T2DM小鼠繼續高脂飼養，均自由飲水，晝夜比為1：1。該實驗方案通過華東師范大學動物實驗倫理委員會批準（動物倫理編號：M20150311）。

1.2 實驗動物訓練方案

利用游泳和下坡跑分別對TS和TD小鼠進行干預，方案如下：游泳：將小鼠放于長度（42 cm）×寬度（40 cm）×水深（36 cm）水箱中進行游泳訓練，水溫為32±1oC，50 min/次，6天/周，共計8周（第1周為適應訓練，前兩天30 min/天，第3～4天40 min/天，第5～6天50 min/天，從第2周開始按50 min/天進行訓練）。下坡跑：0.8 km/h、50 min/次，1次/天、坡度-9°、6天/周，共計8周（第1周為適應訓練，前兩天30 min/天，第3～4天40 min/天，第5～6天50 min/天，從第2周開始按50 min/天進行訓練）。

1.3 實驗動物取材

摘除小鼠眼球，利用1.5ml離心管收集全血，4℃過夜后，按1000 rpm×10 min離心，取血清并存于-80℃冰箱中以備ELISA檢測相關指標；取小鼠左股骨并將肌肉等去除干凈，以備利用微計算機斷層掃描技術（Micro computed tomography, Micro-CT）檢測股骨遠端骨組織形態計量學指標；取小鼠骨髓巨噬細胞（Bone marrow-derived macrophage, BMM），進行細胞原代培養并誘導其向破骨細胞（Osteoclast, OC）分化；取小鼠右側后肢骨用于相關因子mRNA（股骨）和蛋白（脛骨）表達檢測。

1.4 指標檢測

1.4.1 股骨骨組織形態計量學指標檢測

股骨4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）固定24 h后，利用Skyscan Micro-CT系統（型號: 1076）按18 μm/幀對其遠端進行掃描，并利用CT An軟件對松/皮質骨骨組織形態計量學指標進行分析，以獲得三維結構圖和骨組織形態計量學指標相關數據。

1.4.2 誘導BMM向OC分化及相關檢測

取小鼠股骨和脛骨骨髓來制備單細胞懸液。離心、棄上清且重懸加入紅細胞裂解液，再離心、棄上清和重懸后。加到6 cm培養皿并置于培養箱中。24 h后對貼壁細胞進行消化、計數，按3萬/孔接于48孔板中。24 h后，培養基中加入核因子-κB受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor-kB ligand, RANKL)誘導BMM向OC分化，每隔2天換液。第5天，4% PFA固定OC后，進行抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色，利用Canon相機和Leica顯微鏡進行拍照并利用Blindness法進行計數[21]。

1.4.3 股骨中相關細胞因子mRNA表達檢測

按標準步驟[1]提取右側股骨中RNA，并按反轉試劑盒步驟（購自Takara Bio）將RNA反轉為cDNA。按實時熒光定量PCR試劑盒（購自Takara Bio）步驟對相關因子的mRNA表達進行檢測。利用Primer premer引物設計軟件對相關引物進行設計后，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.4 骨中Src1和NFATc1的蛋白表達檢測

按標準步驟[21]提取骨中蛋白，利用BCA法[23]測定濃度后，蛋白變性。10%和12%分離膠電泳后將蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉，分別Ⅰ抗4℃和Ⅱ抗室溫孵育。TBST洗膜后，利用Alpha凝膠成像系統對PVDF膜進行顯影拍照并利用自帶軟件進行數據分析。

1.4.5 血清中三磷酸肌醇(Inositoltriphosphate, IP3 )和Ca2+濃度檢測

按酶聯免疫試劑盒（IP3 ELISA Kit購自CSB；Ca2+ELISA Kit購自SIGMA）步驟要求進行血清IP3和Ca2+濃度檢測，每個樣品做一平行樣。

1.5 數據處理方法

利用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS18.0對實驗檢測的數據進行統計、分析（ZC和TC兩組之間進行獨立樣本檢驗，TC、TS和TD 3組之間進行單因素方差分析），<0.05和<0.01分別表示差異具有顯著性和差異具有非常顯著性。

2 實驗結果

2.1 游泳和下坡跑對T2DM小鼠股骨遠端骨組織形態計量學指標的影響

圖1 T2DM小鼠運動后股骨遠端松質骨骨組織形態結構變化

Figure 1 Changes of Morphological Structure of Trabecular after Exercises

表2 T2DM小鼠運動后股骨遠端松質骨形態計量學指標的變化

注：與ZC組相比，“*”表示＜0.05，“**”表示＜0.01；與TC組相比，“★”表示＜0.05，“★★”表示＜0.01；與TS組相比，“●”表示＜0.05。

由圖1和表2可知，與ZC組相比，TC組小鼠股骨遠端松質骨BMD、BV、BV/TV、BS、IS、BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著下降，而BS/BV和Tb.Sp顯著升高(＜0.05或＜0.01)。與TC組相比，TD組小鼠股骨遠端松質骨BMD、BV、BV/TV、BS、IS、BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N均呈現顯著性變化(＜0.05或＜0.01)。與TS組相比，TD組小鼠股骨遠端松質骨BS/TV顯著性增加(＜0.05)。TS組與TC組之間沒有顯著差異。

分析表3可知，與ZC組相比，TC組小鼠股骨遠端皮質骨BMD、IS和Tb.Th均顯著下降(＜0.05或＜0.01)。與TC組相比，TD組小鼠股骨遠端皮質骨BV/TV、BS/BV和Tb.Th均出現顯著變化（＜0.05）。TS組與TC組之間沒有顯著差異。

2.2 游泳和下坡跑對T2DM小鼠BMM分化產生的OC數量影響

表3 T2DM小鼠運動后股骨遠端皮質骨骨形態計量學指標變化

注：與ZC組相比，“*”表示＜0.05，“**”表示＜0.01；與TC組相比，“★”表示＜0.05。

圖2 T2DM小鼠運動后OC分化產生數量的影響

Figure 2 Changes of OC Number in T2DM Mice after Exercises

表4 T2DM小鼠運動后骨髓BMM分化產生OC數量的變化

注：與ZC組相比，“**”表示＜0.05；與TC組相比，“★”表示＜0.05，“★★”表示＜0.01；與TS組相比，“●”表示＜0.05。

由圖2和表4可知，與ZC組相比，TC組小鼠骨髓中BMM分化產生的OC總數量和≥10個核OC數量顯著增多（<0.01），TD組小鼠BMM分化產生的OC總數量和≥10個核OC數量顯著少于TC組和TS組（＜0.05或＜0.01）；TS組與TC組無顯著差異。

2.3 游泳和下坡跑對T2DM小鼠股骨中相關因子mRNA表達的影響

表5 T2DM小鼠運動后股骨中相關因子mRNA表達變化（±SD，n=6）

注：與ZC組相比，“*”表示＜0.05，“**”表示＜0.01；與TC組相比，“★”表示＜0.05，“★★”表示＜0.01；與TS組相比，“●”表示＜0.05，“●●”表示＜0.01。

分析表5可知，與ZC組相比，TC組小鼠股骨中腫瘤壞死因子受體相關因子6（Tumor necrosis factor receptor-related factor, TRAF6）、類固醇受體輔助激活因子-3(Steroid receptor coactivator-3, Src3)、CN、磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)、NFATc1和TRAP的mRNA表達均顯著上調(＜0.05或＜0.01)。與TC組相比，TS組小鼠股骨中TRAF6、PLC、CN和TRAP的mRNA表達顯著下調(＜0.05或＜0.01)，TD組小鼠股骨中TRAF6、Src-3、PLC、CN、NFATc1和TRAP mRNA表達均顯著下調(＜0.05或＜0.01)。與TS組相比，TD組小鼠股骨中TRAF6、Src-3、PLC和TRAP mRNA表達均顯著下調(＜0.05或＜0.01)。

2.4 游泳和下坡跑對T2DM小鼠脛骨中Src1和NFATc1蛋白表達的影響

圖3 T2DM小鼠運動后脛骨中Src1和NFATc1蛋白表達變化

Figure 3 Changes of Src1and NFATc1 Protein Expression after Exercises

表6 T2DM小鼠運動后脛骨中Src1和NFATc1蛋白表達變化

注：與ZC組相比，“**”表示＜0.01；與TC組相比，“★”表示＜0.05；“★★”表示＜0.01。

由圖3和表6可知，與ZC組相比，TC組小鼠脛骨中Src1和NFATc1蛋白表達顯著上調（＜0.01）。與TC組相比，TS組小鼠脛骨中Src1蛋白表達顯著下調（＜0.01）；TD 組小鼠脛骨中Src1和NFATc1蛋白表達均顯著下調＜0.05或＜0.01)，TD組與TS組之間無差異。

2.5 游泳和下坡跑對T2DM小鼠血清中IP3和Ca2+濃度的影響

表7 T2DM小鼠運動后血清IP3和Ca2+濃度變化

注：與ZC組相比，“*”表示＜0.05；與TC組相比，“★”表示＜0.05；與TS組相比，“●”表示＜0.05。

表7可知，與ZC組相比，TC組小鼠血清中IP3和Ca2+濃度均顯著升高（＜0.05）。與TC組相比，TS組小鼠血清中Ca2+濃度顯著下降（＜0.05）；TD組小鼠血清中IP3和Ca2+濃度均顯著下降（＜0.05）。與TS組相比，TD組小鼠血清中IP3和Ca2+濃度均顯著下降（＜0.05）。

3 分析討論

3.1 游泳和下坡跑對T2DM小鼠股骨遠端骨組織形態計量學指標的影響

T2DM作為一內分泌代謝性疾病，其骨代謝紊亂，骨組織形態結構退化，骨小梁參數：BV/TV、Tb.N、Tb.Th和BMD等均顯著下降[27,28]。人體研究發現，T2DM老年男性股骨頸和第3腰椎BMD下降，導致骨質疏松發生[8]。利用磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）對37名（平均年齡70.8歲）T2DM女性2年間脛骨遠端松質骨骨小梁結構變化進行檢測，發現BV/TV、Tb.Th、Tb.N等顯著下降，導致骨質疏松發生[16]。無論動物還是人體研究均證實，T2DM骨代謝紊亂，導致骨組織形態結構退化及骨質疏松發生。本研究T2DM小鼠造模成功8周后，其股骨遠端的松質骨BMD、BV/TV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N等及皮質骨BMD、Tb.Th和BS/BV均顯著下降，BS/BV和Tb.Sp顯著升高，這與以上文獻報道相一致。表明，本研究T2DM小鼠造模成功，另一方面，說明T2DM小鼠骨吸收超過骨形成，使得骨組織形態結構退化，而松質骨骨組織形態結構退化速度快于皮質骨，這與骨代謝發生變化時，先表現在松質骨有關[24]。

運動是改善T2DM骨代謝的重要手段。8周中等強度游泳顯著提高T2DM大鼠股骨BMD和最大載荷等生物力學指標[4]。而8周跑臺訓練亦可提高T2DM大鼠BMD和骨生物力學性能[2]。人體研究證實，長時間、規律的體育鍛煉顯著提高T2DM患者（男/女性）股骨頸、Ward's三角等部位BMD，改善骨質疏松[10,13]。本研究發現，TD組松質骨BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等指標顯著升高，皮質骨僅BV/TV、BS/BV和Tb.Th出現變化；而TS組松質骨和皮質骨的其他指標均無顯著變化。提示，下坡跑顯著改善T2DM小鼠骨組織形態結構，尤其是松質骨。這與下坡跑運動中，T2DM小鼠骨組織受到較大強度的地面反作用力（亦稱直接力學刺激）有關[1]，直接力學刺激促進成骨細胞分化及其骨形成能力，并抑制OC分化、融核及骨吸收能力[3]，進而改善骨組織形態結構，并首先表現在松質骨上[24]。TS組松質骨和皮質骨的骨組織形態計量學指標均無顯著變化，說明游泳對T2DM小鼠骨組織形態結構的改善作用不顯著，這與趙劍等研究結果不一致。分析原因，與本研究游泳運動強度較小有關，強度較小的游泳運動對T2DM小鼠骨產生的力學刺激（即肌肉牽拉力）未能達到提高骨代謝的閾值，使得骨組織形態結構未顯著改善。還可能與本研究中游泳訓練時間較短有關。

3.2 游泳和下坡跑對T2DM小鼠BMM分化產生OC數量的影響

OC由BMM分化產生后，通過融核形成具有較強骨吸收能力的多核OC來主導骨吸收，并表達骨吸收生化標志物——TRAP[14]。T2DM小鼠BMM分化產生的OC和多核OC數量增多，骨吸收能力增強，導致骨質疏松發生[11]。本研究中，發現T2DM小鼠OC總數量和≥10個核OC數量顯著增多。表明，T2DM促進小鼠BMM向OC分化、融核及其骨吸收能力，這與前人研究結果相一致。究其原因，T2DM可激活骨中骨保護素（Osteoprotegerin, OPG）/RANKL/核因子-κB受體活化因子（Receptor activator of nuclear factor-κB, RANK）分子軸，上調核轉錄因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）、c-Fos、NFATc1等靶基因表達，促進OC分化、融核及其骨吸收能力。并且，T2DM小鼠骨組織形態結構退化與分化產生的OC數量增加及其活性升高密切相關，OC會在骨基質Howship陷窩內形成酸性微環境，以吞噬泡形式降解骨質，使得松質骨和皮質骨形態結構退化[34]。

T2DM骨質疏松發生，與BMM分化產生的OC數量增加及骨吸收能力升高密切相關。運動訓練作為改善骨組織形態結構的重要手段，其在抑制OC分化、融核及骨吸收能力上亦扮演關鍵角色[35]。但體育科學領域內，有關運動抑制T2DM小鼠BMM向OC分化及融核的相關研究尚待揭示。8周運動結束后，TD組OC總數量和≥10個核OC數量均顯著下降，而TS組變化不顯著。并且，TD組OC總數量顯著低于TS組。說明下坡跑顯著抑制T2DM小鼠OC分化產生、融核及骨吸收能力，而游泳效果不顯著。這與下坡跑對T2DM小鼠骨產生的直接力學刺激可抑制其骨中OPG/ RANKL/RANK分子軸、IL-6和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）、NF-κB等激活或表達有關[30,31]。以上信號途徑或細胞因子表達被抑制后，促進BMM向單核OC分化及單核OC融核形成具有較強骨吸收功能的多核OC[32]。游泳作用效果不顯著，與其對T2DM小鼠骨產生的肌肉牽拉力強度較小，不能對BMM形成有效的力學刺激有關，從而抑制其向OC分化。然而，作為調控骨吸收代謝關鍵信號途徑的CN/NFAT途徑，其在調控OC分化及其骨吸收能力上具有重要調控作用。Ayse BC等[5]在研究間質液體剪切力和拉伸應變對骨細胞的影響時，發現這兩種力學刺激均能抑制CN/NFAT途徑激活。然而，目前有關運動抑制CN/NFAT途徑，進而調控T2DM小鼠OC分化、融核及其骨吸收能力的相關研究尚待補充。

3.3 游泳和下坡跑對T2DM小鼠骨中CN/NFAT信號途徑分子表達的影響

CN/NFAT是調控骨吸收的關鍵途徑。TRAF6磷酸化后，活化Src1/3 (Src1起主要調控作用)，并作用于PLC及IP3，促進胞內Ca2+濃度升高引起CN活化，激活NFATc1并迅速轉移入核，調控OC前體細胞向OC分化及單核OC向多核OC融核，增強骨吸收[6]。T2DM小鼠分化產生的OC和多核OC數量顯著增加，該過程受CN/NFAT途徑調控，當其關鍵因子NFATc1激活后，促進BMM向OC分化及單核OC融核，使得骨吸收增強[18]。本研究顯示，T2DM小鼠骨中TRAF6、Src3、CN和NFATc1的mRNA表達上調，IP3和Ca2+濃度升高，且關鍵因子Src1和NFATc1蛋白表達及骨吸收標志因子TRAP表達亦上調，這與前人研究結果相一致。提示，T2DM小鼠骨中CN/NFAT途徑被激活，從而促進BMM向OC分化產生及融核，導致骨組織形態結構退化。

運動是改善T2DM骨代謝的重要手段，而目前相關研究集中在骨表型上。作為調控T2DM骨吸收的重要信號途徑—CN/NFAT，運動影響T2DM小鼠骨中該途徑表達的相關研究尚待揭示。本研究中，TD組小鼠骨中TRAF6、Src3、PLC、CN、NFATc1、TRAP的mRNA和Src1、NFATc1蛋白表達下調，IP3和Ca2+濃度下降。TS組TRAF6、PLC、CN、TRAP的mRNA和Src1蛋白表達及Ca2+濃度均下降，NFATc1 mRNA和蛋白表達不顯著。而研究證實，NFATc1是評價CN/NFAT途徑激活與否的關鍵靶基因，當其被激活后促進OC分化及其活性[25,33]。并且，與TS組相比，TD組TRAF6、Src3、PLC、TRAPmRNA和NFATc1蛋白表達及IP3和Ca2+濃度均低于TS組。表明，下坡跑抑制T2DM小鼠骨中CN/NFAT信號途徑激活，而游泳卻不能。證實，直接力學刺激改善T2DM骨吸收的作用效果優于間接力學刺激。直接力學刺激可抑制T2DM小鼠骨中OPG/RANKL/RANK分子軸，而TRAF6與RANK胞質區結合去磷酸化后抑制CN/NFAT途徑激活[36]。再者與其抑制T2DM小鼠骨中Rho/蛋白激酶C1（Protein kinase C1, PKC1）信號通路和肌動蛋白聚合、肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain, MyHC）、骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein 2, BMP-2）、白介素3（Interleukin 3, IL-3）和激活細胞表面糖蛋白147（Cell surface glycoprotein147, CD147）等有關[22,37]。以上信號途徑或關鍵分子的抑制或激活均可抑制T2DM小鼠骨中鈣調神經磷酸酶調節因子（Calcineurin-regulating factor, RCANs）與CN上由7個外顯子編碼的PxIxxT區域結合[29]，進而抑制下游分子及靶基因NFATc1表達。而直接力學刺激激活Wnt5a與其膜上受體復合物結合后，可活化胞內散亂蛋白2（Dishevelled, DVL2），抑制CN及其下游NFATc1等基因表達[9,12]。

4 結論

T2DM小鼠骨吸收增強，導致骨質疏松發生；下坡跑通過抑制T2DM小鼠骨中CN/NFAT途徑，導致OC及多核OC數量下降，骨吸收降低，進而改善骨組織形態結構，且其作用效果優于游泳對骨產生的間接作用力。

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Effects of Swimming and Downhill Running on Bone Absorption Metabolism in Type 2 Diabetic Mice via CN/NFAT Signal Pathway

CHEN Xiang-he1, LI Shi-chang2, SUN Peng2, CHEN Ai-guo1, MA Tao3, MOU Qi-lin4

1.Yangzhou University, Yangzhou 225127, China; 2. East China Normal University, Shanghai 200241, China; 3. Qilu Normal University, Jinan 250200, China; 4.Guiyang University, Guiyang 550000, China.

Objective: The purpose of this study was to explore the effect of swimming and downhill running on bone resorption and metabolism in T2DM mice through calcineurin (CN)/activated T-cell nuclear factor (NFAT) pathway. Methods: Six-week high-fat diet and one-time injection of streptozotocin (STZ) were used to make T2DM models. After it, the mice were randomly divided into T2DM control group (TC), T2DM swimming group (TS) and T2DM downhill running group ( TD), C57 mice were selected as normal control group (ZC). T2DM mice continued to have a high-fat diet and mice of ZC group were fed normal diets. The mice of TS and TD group were trained for 8 weeks swimming and downhill running. After 24 hours of the last training, the mice were sacrificed and each bone samples were harvested. Microscopy, primary cell culture, ELISA, RT-PCR, and West-blotting techniques were used to measure bone histomorphometry, OC number, ion concentration , mRNA and protein expression of cytokine were detected. Results: The expressions of TRAF6, CN, Src-3, PLC, NFATc1, TRAP mRNA and Src1, NFATc1 protein were up-regulated in TC group (<0.05), and the concentrations of IP3 and Ca2+were increased (<0.05). The total number of OC and the number of ≥10 nuclear OCs were increased (<0.01). Histological indicators of cancellous bone and cortical bone were significantly decreased (<0.05). Compared with TC, the expression of TRAF6, CN, PLC, TRAP mRNA and Src1 protein in TS group were down-regulated, and Ca2+concentration was also decreased (<0.05 or<0.01). The expression of TRAF6, CN, Src-3, PLC, NFATc1, TRAP mRNA and Src1, NFATc1 protein were down-regulated in the TD group, and the IP3 and Ca2+ concentrations were also decreased (<0.05). The total number of OC and ≥10 nuclear OC were significantly decreased (<0.05), and histomorphometric indexes of cancellous bone and cortical bone were significantly improved (<0.05). Compared with TS, the expression of TRAF6, Src-3, PLC, TRAP mRNA were down-regulated and the concentration of IP3 and Ca2+ were decreased (<0.05). The total number of OC decreased (<0.05) and the BS/TV of cancellous bone were increased (<0.05). Conclusion: The bone resorption of T2DM mice was enhanced. Downhill running inhibited the CN/NFAT pathway in bone of T2DM mice, reduced the number of OC, decreased the bone resorption, and improved the morphological structure of bone, and its effect was better than swimming.

G804.5

A

1002-9826(2018)04-0113-07

10.16470/j.csst.201804013

2017-07-21；

2018-06-06

江蘇省高等學校自然科學研究面上項目(17KJB180017)。

陳祥和,男,講師,博士,主要研究方向為運動與骨適應的機制, E-mail:huashixh@163.com。