miR-499對缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡的影響

岳 瑩，呂風華，陳玉磊，王 卓，司澳洋

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內科 河南衛(wèi)輝 453100

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)嚴重威脅人類健康。臨床上對于AMI的治療主要是通過溶栓、經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)、冠脈搭橋等手段快速恢復缺血心肌的血液供應，避免持續(xù)性的心肌缺血缺氧；然而當缺血心肌血供恢復后，局部缺血心肌組織損傷反而會加重，引起心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。如何有效地避免缺血再灌注所引起的心肌細胞損傷是當前臨床AMI治療過程中亟待解決的問題。相關研究[1-2]顯示，MIRI所引起的心肌損傷與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K/Akt)等信號分子的活化有密切關系。MicroRNAs (miRNAs) 是一類含約22個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，已有研究[3]證實有多種心肌特異性miRNA在MIRI過程中異常表達，人類miR-499位于MYH7B基因內含子19(染色體20q11.2)的位置，以反向平行的方式進行轉錄，參與心臟的發(fā)育、心肌肥厚、心力衰竭及MIRI等病理生理過程。相關研究[4]提示，miR-499的表達可能在AMI過程中起重要調節(jié)作用。雖然PI3K/Akt信號通路及miR-499在心肌梗死中均有研究，但它們之間的關系卻鮮有報道。該研究旨在利用原代心肌細胞急性缺氧/復氧模型，模擬MIRI，觀察miR-499在急性缺氧/復氧條件下對心肌細胞凋亡的影響，并探討其與PI3K/Akt信號通路之間的關系。

1 材料與方法

1.1動物及試劑2～3日齡新生大鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物實驗中心提供；Ⅱ型膠原酶、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基和低糖培養(yǎng)基(北京索萊寶生物科技有限公司)；青霉素、鏈霉素(上海遠慕生物科技有限公司)；miR-499激動劑agomir(廣州銳博生物科技有限公司)；PI3K特異性阻斷劑LY294002(美國Pepro Tech公司)；RNAiso-Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)[寶生物工程(大連)有限公司]；熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)；Caspsae-3抗體(英國Abcam公司)；PI3K/Akt及磷酸化PI3K/Akt信號通路抗體(美國CST公司)；HRP 羊抗兔 IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2原代心肌細胞的培養(yǎng)取2～3日齡新生大鼠，浸入體積分數(shù)75%乙醇中消毒，打開胸腔，取出心臟，放入高糖培養(yǎng)基中，去除血管、心房肌等多余組織，清洗數(shù)遍后將心室肌剪碎；加入1.5 mL消化酶，在培養(yǎng)箱中消化8 min(每4 min取出振蕩1次)，取上清于50 mL離心管中，并向離心管中加入1.5 mL含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基終止消化；重復上述步驟直至消化完全，用200目濾網過濾，分離成單個細胞，1 200 r/min離心5min，棄上清，向沉淀中加入5 mL含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基制成細胞懸液。采用差速貼壁法分離心肌細胞與成纖維細胞。吸取上層未貼壁細胞，接種于培養(yǎng)皿中，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，2 d后換液，可觀察到細胞跳動，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3細胞缺氧/復氧模型的構建參考文獻[5]的方法，將無血清低糖DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃低氧密閉培養(yǎng)箱中，持續(xù)通入體積分數(shù)95% N2+體積分數(shù)5%CO2混合氣體3 h(流速為2 L/min)，充分飽和無血清低糖DMEM培養(yǎng)基。將上述培養(yǎng)基迅速置換培養(yǎng)皿中的高糖培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)皿放入低氧裝置中培養(yǎng)3 h；之后將培養(yǎng)液更換為含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基并置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中復氧4 h。

1.4實驗分組及處理取心肌細胞，隨機分成正常對照組(37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、體積分數(shù)95%空氣正常培養(yǎng))、缺氧/復氧組(A/R組，按照上述步驟構建模型)、缺氧/復氧+miR-499 agomir預處理組(Agomir組，在缺氧前48 h，于培養(yǎng)基中加入終濃度為50 nmol/L[6]的miR-499 agomir構建模型)和缺氧/復氧+miR-499 agomir+PI3K特異性阻斷劑LY294002組[Agomir+LY294002組，缺氧前于培養(yǎng)基中加入 LY294002(10 μmol/L)[7]，余同Agomir組]4組。

1.5各組心肌細胞活力的MTT檢測調整細胞密度至1×107L-1；取150 μL/孔接種于96孔板中，3 d后隨機分組給予對應處理后棄培養(yǎng)基，細胞分組及處理同1.4。每孔加入90 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基和10 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄上清，于避光條件下加入150 μL DMSO，搖床上振蕩10 min，利用酶標儀檢測各孔吸光度值(A值)(檢測波長為490 nm)。心肌細胞活力=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.6各組細胞中miR-499、PI3KmRNA表達的熒光定量PCR檢測引物設計見表1，miR-499上下游引物及U6上下游引物由廣州銳博生物科技有限公司設計合成；采用Trizol提取實驗各組心肌細胞總RNA，檢測RNA濃度，按試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，再行熒光定量PCR。PCR反應條件：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃融解；50 ℃ 30 s降溫。采用 2-ΔΔCT法計算PI3K、miR-4991 mRNA的表達水平。實驗均重復5次。

表1 引物設計

1.7各組細胞中Caspase-3及PI3K/Akt蛋白表達的Westernblot檢測向心肌細胞中加入150 μL RIPA裂解液，加入PMSF(檢測磷酸化Akt和PI3K時需加入蛋白磷酸酶抑制劑)，利用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，以RIPA裂解液及Loading buffer調整蛋白濃度。配置分離膠及積層膠進行電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉，一抗封閉過夜，二抗孵育1 h，ECL化學發(fā)光法使條帶顯影，保存圖片，采用Image J圖像分析軟件測定灰度值。實驗重復5次。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較4組心肌細胞活力、心肌細胞中PI3K、miR-499 mRNA相對表達量及細胞中Caspase-3、PI3K/Akt蛋白表達量的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組心肌細胞活力、心肌細胞中PI3K及miR-499mRNA相對表達量的比較見表2。由表2可知，與正常對照組相比，A/R組心肌細胞活力下降，miR-499 mRNA表達量下降；與A/R組相比，Agomir組心肌細胞活力增加，PI3K mRNA表達增加。

表2 4組心肌細胞活力、心肌細胞中PI3K及miR-499 mRNA相對表達量的比較

*：與正常對照組相比，P<0.05；#：與A/R組相比，P<0.05；△：與Agomir組相比，P<0.05

2.2 4組心肌細胞中Caspase-3、PI3K/AKt蛋白表達量的比較見圖1、表3。由表3可知，與正常對照組相比，A/R組Caspase-3蛋白表達增加，p-PI3K、p-Akt表達量減少；與A/R組相比，Agomir組蛋白Caspase-3蛋白表達減少，p-PI3K、p-Akt表達量增加；與Agomir組相比，Agomir+LY294002組p-PI3K、p-Akt蛋白表達量減少。

1：正常對照組；2：A/R組；3：Agomir組；4：Agomir+LY294002組

圖1 4組心肌細胞中Caspase-3、PI3K/Akt蛋白表達量的比較

表3 4組心肌細胞中Caspase-3、PI3K/Akt蛋白表達量的比較

*：與正常對照組相比，P<0.05；#：與A/R組相比，P<0.05；△：與Agomir組相比，P<0.05

3 討論

miRNAs是一類含約22個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，相關文獻[8-9]報道某些miRNAs表達的上調或下調可影響部分心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，糾正這些miRNAs的異常表達可使某些心血管疾病得以逆轉，這為治療心血管疾病提供了新的靶點。Li等[10]的研究結果顯示，缺氧誘導培養(yǎng)的心肌細胞中miR-499的表達降低，這與本研究結果一致。Wang等[11]研究結果顯示，miR-499通過保護心肌細胞免受H2O2誘導的細胞凋亡而具有心臟保護作用；在大鼠心肌細胞過表達 miR-499時，可抑制線粒體凋亡從而增加細胞存活率。Wang等[12]的研究顯示，miR-499可通過鈣依賴磷酸酶所介導的動力相關蛋白-1去磷酸化而抑制心肌細胞凋亡。Zhu等[13]的研究顯示，miR-499的心臟保護作用可能是通過程序性細胞死亡因子4來實現(xiàn)。本研究結果顯示，與正常對照組相比，A/R組miR-499表達量減少，Caspase-3表達量增加；而增加miR-499的表達，Caspase-3表達量下降，提示在缺氧/復氧情況下miR-499表達量下降，增加miR499的表達可減少缺氧/復氧誘導的心肌細胞的凋亡。

PI3K/Akt信號轉導通路是體內最重要的細胞生存相關激酶途徑之一，其與心肌細胞存活和凋亡密切相關，被稱為再灌注損傷補救激酶通路[14]。Akt是PI3K下游靶點分子，它的Thr308位點磷酸化和Ser473羧基端磷酸化，能進一步使下游靶分子(如Bad和Caspase-9等)磷酸化而失活，調控抗凋亡相關基因的轉錄，促進細胞存活[15-17]。相關動物實驗(兔、大鼠、犬等多種心肌缺血再灌注模型)[18-20]證實：PI3K/Akt通路的活化可發(fā)揮心肌保護作用，抑制心肌細胞凋亡。MIRI時會激活多種保護性通路減輕心臟損害，有研究[21]結果顯示，干預PI3K/Akt等信號的表達可有效地預防MIRI所造成的心肌細胞損傷。本研究的結果顯示，與正常對照組相比，A/R組PI3K mRNA表達量、p-PI3K及p-Akt蛋白表達量減少；但經Agomir處理(增加miR-499的表達)后，與A/R組相比，Agomir組PI3K mRNA表達量、p-PI3K及p-Akt蛋白表達量增加；提示miR-499可能是通過PI3K/Akt信號通路來減少缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡。而加入PI3K特異性阻斷劑LY294002后，miR-499的這種細胞保護作用被抑制，這一結果再次驗證了miR-499可能是通過PI3K/Akt信號通路抑制缺氧/復氧所誘導的心肌細胞的凋亡。

本研究結果顯示miR-499在MIRI中發(fā)揮重要作用，過表達miR-499可減少缺血再灌注損傷中心肌細胞的凋亡，而miR-499可能是通過激活PI3K/Akt信號通路產生這種心肌保護作用，但miR-499是如何激活PI3K/Akt信號通路而產生心肌保護作用仍需進一步研究。