沙棘多糖對(duì)撲熱息痛誘導(dǎo)的小鼠肝損傷保護(hù)作用的研究①

王昕旭 王 雪 張曉慧 鄒 凱 劉春妍 顏 妍 王玉珍 趙世敏

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,呼和浩特 010018)

沙棘(Hippophae rhamnoides,Linn.)，為胡頹子科沙棘屬植物,落葉灌木或小喬木，又名醋柳、酸刺等。沙棘果中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)十分豐富，其許多成分在腫瘤的預(yù)防治療以及增強(qiáng)免疫力、抗衰老、防止血管栓塞等方面有著很好的效果，具有很高的藥用價(jià)值[1]。多糖是有機(jī)體必需物質(zhì)，與維持生物機(jī)能密切相關(guān)，而天然多糖具有抗氧化、抗菌、抗病毒等許多生物學(xué)功能，近年來(lái)也受到了廣泛的重視和研究，其中又以植物多糖研究最為廣泛[2-5]。《中醫(yī)大辭典》記載沙棘果有活血散瘀、化痰寬胸、補(bǔ)脾健胃、生津止渴、清熱止瀉等之功效。目前，對(duì)于沙棘也進(jìn)行了一些研究[6]，但對(duì)于其多糖的研究并不廣泛，在藥物性肝損傷方面的研究也不是很多，所以，本實(shí)驗(yàn)以從沙棘果中提取的沙棘多糖(Seabucthorn polysaccharide,SP)為研究對(duì)象，探究其在撲熱息痛(Acetaminophen,APAP)誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷組織中的保護(hù)作用。

APAP是臨床上一種常見(jiàn)的非抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥，在其規(guī)定的劑量范圍內(nèi)，其治療效果良好且無(wú)副作用，如若超過(guò)其服用劑量，則會(huì)造成嚴(yán)重的急性肝損傷以及腎功能衰竭，嚴(yán)重的患者還可導(dǎo)致死亡。在發(fā)達(dá)國(guó)家，APAP導(dǎo)致的急性肝損傷的發(fā)展趨勢(shì)迅猛，已經(jīng)在一定程度上影響了人們的生活質(zhì)量。其中對(duì)于那些常規(guī)治療無(wú)效者，肝移植是唯一挽救的方法[7]，不過(guò)，即使在滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)的患者中，超過(guò)20%將在1年內(nèi)死亡，而一半患者將在未來(lái)10年內(nèi)死亡[8]。由此可見(jiàn)，APAP所引起的肝損傷情況并不樂(lè)觀(guān)，所以，對(duì)于藥物性肝損傷的預(yù)防與治療也尤為受到關(guān)注。

藥物性肝損傷是一個(gè)多因素多機(jī)制的復(fù)雜過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制不僅與氧化應(yīng)激有關(guān)，炎癥反應(yīng)在其發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程及預(yù)后中也起到重要作用[8]。肝臟是人體重要的免疫器官，在藥物性肝損傷發(fā)病過(guò)程中，炎癥反應(yīng)是造成肝損傷的主要原因和重要機(jī)制之一[9]，其主要促成因素是Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)，TLR通過(guò)與配體結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(Tumor necroisi factor α,TNF-α)、IL-1β和IL-6等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而加劇藥物性肝損傷的發(fā)生[10]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑 8周齡雄性C57BL/6小鼠40只,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;APAP和NAC購(gòu)自阿拉丁試劑公司;組織蛋白提取液購(gòu)自康為世紀(jì)生物有限公司;BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司；總 RNA 抽提試劑 Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa生物公司；TLR4一抗購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling 公司；Western blot二抗購(gòu)自 LI-COR 公司。

1.2方法

1.2.1沙棘多糖的提取與測(cè)定 采用水提醇沉法提取沙棘果實(shí)多糖組分[11]。沙棘漿果粉采用固體：液比1∶20(w/v)的比例熱水提取4次(80℃)，之后乙醇分級(jí)沉淀，Sevage法去除蛋白，木瓜蛋白酶消化。SP經(jīng)Sephadex G150凝膠(Pharmacia)后高效液相色譜法檢測(cè)其純度。結(jié)果表明，SP由75%糖、14.2%糖醛酸組成。色譜分析顯示，多糖是由甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和鼠李糖組成，其摩爾比為：2.02∶1.02∶4.24∶1∶9.22[11]。

1.2.2APAP藥物性肝損傷模型的構(gòu)建 C57BL/6系雄性系小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，即空白組(Ctrl)、APAP模型組(APAP，350 mg/kg)、N-乙酰半胱氨酸組(NAC，150 mg/kg)、SP低劑量組(APAP/SP100，100 mg/kg)、SP高劑量組(APAP/SP200，200 mg/kg)和SP對(duì)照組(SP200，200 mg/kg)，SP連續(xù)灌胃30 d，空白組和模型組灌等體積的生理鹽水，NAC在造模1 h前腹腔注射，16 h后將小鼠處死，采集血清以及肝臟樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3血清中ALT、AST檢測(cè) 小鼠血清經(jīng)過(guò)離心稀釋處理之后由內(nèi)蒙古人民醫(yī)院全自動(dòng)生化分析儀測(cè)其ALT、AST水平。檢測(cè)結(jié)果由內(nèi)蒙古人民醫(yī)院檢測(cè)科提供。

1.2.4肝臟病理學(xué)檢測(cè) 通過(guò)事先固定好的肝組織用石蠟切片包埋，并制成5 μm的薄片，采用蘇木素-伊紅染色法，之后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察肝組織整體情況以及細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)，炎性浸潤(rùn)情況，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整性等。

1.2.5Western blot檢測(cè) 肝臟組織按照重量∶體積=1∶9的比例加入組織蛋白抽提液，經(jīng)破碎后4 000 r/min離心10 min，即得到10%的肝臟勻漿，利用BCA試劑盒方法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。檢測(cè)濃度之后各組取等量蛋白提取液，經(jīng)SDS-PAGE 泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上;取膜并用脫脂奶粉封閉后，與兔抗鼠TLR4的單克隆抗體(1∶1 000)于 4℃ 反應(yīng)過(guò)夜，洗膜后再與羊抗兔 IRDye800CW 二抗(1∶15 000)室溫反應(yīng) 2 h，洗膜后利用 ODYSSEY CLX 檢測(cè)特異性蛋白條帶，采用 Imagine Studio 軟件分析。

1.2.6Real-time PCR分析 采用Trizol法提取肝組織中的RNA，上樣量為500 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，引物序列見(jiàn)表1,Real-time PCR 計(jì)算方法采用 2-ΔΔCT法。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)間顯著性差異通過(guò)SPSS鄧肯氏多重比較法計(jì)算，P<0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SP對(duì)血清中ALT、AST水平的影響 SP采用連續(xù)灌胃30 d的方式來(lái)評(píng)估其安全性。如圖1所示，SP對(duì)照組(SP200，200 mg/kg)ALT和AST的活性與空白組小鼠的活性沒(méi)有顯著差異，表明SP給藥不誘導(dǎo)肝毒性,是安全可用的；與空白組相比，模型組的ALT和AST水平明顯提高，SP各劑量組的水平明顯降低且呈一定的劑量依賴(lài)性，各劑量組與模型組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1Real-timePCR引物序列

Tab.1PrimersequencesofReal-timePCR

PrimernamePrimersequenceIL?6antisense5′?TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC?3′IL?6sense5′?TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC?3′TNF?αantisense5′?TTGATGGTGGTGCATGAGAG?3′TNF?αsense5′?AAACACAAGATGCTGGGACA?3′

2.2SP對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝損傷的影響 利用石蠟包埋小鼠肝組織并切成薄片，HE染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下，觀(guān)察小鼠肝組織情況。如圖2所示在空白組(生理鹽水)中，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核無(wú)損壞；與空白組相比，模型組(APAP，350 mg/kg)能夠看到明顯的肝細(xì)胞核破裂，肝細(xì)胞的壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及壞死灶；SP低劑量組(APAP/SP100，100 mg/kg)中仍能看到多個(gè)壞死灶；而在SP高劑量組(APAP/SP200，200 mg/kg)以及N-乙酰半胱氨酸組(NAC，150 mg/kg)中顯示肝細(xì)胞的損壞情況以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死灶等均有所的減輕；SP對(duì)照組(SP200，200 mg/kg)中可見(jiàn)細(xì)胞狀態(tài)正常，無(wú)損傷產(chǎn)生。說(shuō)明SP能夠通過(guò)抑制肝損傷組織中炎癥，起到保肝的效果。

2.3SP對(duì)肝組織TLR4和p-JNK的影響 如圖3所示，與空白組相比，SP對(duì)照組表達(dá)正常，而模型組TLR4表達(dá)量顯著提高(P<0.01)；N-乙酰半胱氨酸組、SP劑量組與模型組相比均明顯降低(P<0.01)。灰度掃描結(jié)果也顯示，模型組含量顯著提高(P<0.01)，SP各劑量組與模型組相比均明顯降低(P<0.01)。說(shuō)明SP可以顯著抑制TLR4的活化(P<0.01)。在圖4中，相對(duì)于空白對(duì)照組，SP對(duì)照組表達(dá)正常，模型組p-JNK明顯升高(P<0.01)，SP各劑量組顯著下降(P<0.01)，高劑量組效果最為顯著，灰度掃描結(jié)果相同，說(shuō)明SP對(duì)p-JNK有抑制作用。

圖1 SP對(duì)血清ALT和AST水平的影響Fig.1 Effects of SP on serum levels of ALT and ASTNote:**.P<0.01.

圖2 SP對(duì)肝組織的影響(HE 染色，×200)Fig.2 Effects of SP on liver tissues(HE staining,×200)

2.4SP對(duì)炎性細(xì)胞因子的影響 如圖5所示，相比空白對(duì)照組，SP對(duì)照組表達(dá)正常，模型組中的TNF-α和IL-6表達(dá)量均明顯升高(P<0.01)，N-乙酰半胱氨酸組和SP高劑量組中TNF-α和IL-6的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，表明高劑量SP對(duì)促炎性因子TNF-α和IL-6有抑制作用(P<0.01)。

圖3 Western blot檢測(cè)沙棘多糖對(duì)TLR4的影響Fig.3 Effects of SP on TLR4 as detected by Western blotNote:**.P<0.01.

圖4 Western blot檢測(cè)沙棘多糖對(duì)p-JNK的影響Fig.4 Effects of SP on p-JNK as detected by Western blotNote:**.P<0.01.

圖5 Real-time PCR檢測(cè)沙棘多糖對(duì)炎癥細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effects of SP on inflammatory cytokines as detected by Real-time PCRNote:**.P<0.01.

3 討論

實(shí)驗(yàn)前期研究結(jié)果表明，SP具有抗炎和抗氧化作用，可以拮抗內(nèi)毒素性肝損傷以及刺激巨噬細(xì)胞的活化與增殖[12,13]。本實(shí)驗(yàn)是進(jìn)一步探究SP對(duì)藥物性肝損傷的保護(hù)作用，采用實(shí)驗(yàn)室自提SP作為治療藥物，NAC(臨床上拮抗APAP毒性的一種治療藥物)作為陽(yáng)性對(duì)照，研究SP對(duì)APAP誘發(fā)的藥物性肝損傷組織的保護(hù)作用機(jī)制，發(fā)揮保肝作用。在以上結(jié)果中顯示，SP對(duì)照組與空白組相比，其所有指標(biāo)均處于正常水平，說(shuō)明SP給藥并不引起肝損傷，是安全可靠的；SP劑量組能夠有效地降低血清中ALT、AST水平，證實(shí)了SP對(duì)APAP誘發(fā)的藥物性肝損傷有保護(hù)作用；在HE染色中我們也進(jìn)一步觀(guān)察到SP劑量組能夠改善肝細(xì)胞的損壞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及壞死灶的程度，發(fā)揮了保肝的功效；Western blot檢測(cè)了TLR4、p-JNK、p-erk、p-p38的表達(dá)，其中p-erk與p-p38的SP治療組與模型組相比，沒(méi)有顯著的降低，因此數(shù)據(jù)中并未顯示。但在SP對(duì)TLR4和p-JNK的結(jié)果中表明SP劑量組能夠顯著抑制藥物性肝損傷組織中TLR4和p-JNK的表達(dá)，說(shuō)明SP是通過(guò)抑制TLR4-p-JNK通路而減輕肝損傷；Real-time PCR結(jié)果也顯示，SP高劑量(200 mg/kg)下對(duì)TNF-α、IL-6的表達(dá)具有明顯的抑制作用。

綜上所述，本研究可以證明SP能通過(guò)抑制APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷組織中的TLR4-p-JNK通路，抑制促炎性因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎活性，減輕肝損傷程度，保護(hù)肝臟免受藥物損害，為藥物性肝損傷的治療提供了新途徑，也為SP作為治療APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷的食用保健型藥物提供了依據(jù)。