ABCG2基因rs3114018單核苷酸多態性與武陵山地區痛風及高尿酸血癥的相關性研究①

夏 燕 陸光輝 黃 瓊 田 瑞 向 陽 向詩非 連思懿 向方華 袁 林

(湖北民族學院風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，恩施 445000)

原發性痛風是由于單鈉尿酸鹽晶體沉積在關節及周圍結締組織而引起的炎癥反應。 其中，高尿酸血癥是痛風發生和痛風石形成的生化基礎，然而并不是所有的高尿酸血癥患者最終都會發展為原發性痛風。研究表明，除了飲食、肥胖等后天因素外，遺傳因素是痛風和高尿酸發病的另一個重要因素[1,2]。多個全基因組關聯研究顯示，尿酸鹽轉運體的基因多態性與血尿酸水平升高和痛風相關[3-5]。ABCG2 基因是編碼表達于腎近曲小管刷狀緣膜上的重要尿酸鹽轉運基因[6]，研究顯示，ABCG2 基因多態性與血尿酸水平升高和痛風發病密切相關，其中Q126X(rs72552713)和Q141K(rs2231142)兩個錯意突變位點，在前期研究中被認為是原發性痛風及高尿酸血癥的易感位點[7-9]，SNP rs3114018是ABCG2另一個錯意性突變位點，近來有研究發現其可能與痛風發生相關[10-12]，但是其與高尿酸血癥的相關性研究未見報道。湖北恩施土家族苗族自治州地處武陵山區，痛風和高尿酸血癥的發病率逐年上升。本研究欲探索武陵山地區人群中ABCG2基因單核苷酸位點rs3114018多態性與原發性痛風、高尿酸血癥的相關性。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2015年10月至2016年12月在湖北民族學院附屬民大醫院體檢中心體檢的高尿酸血癥、風濕免疫科的原發性痛風患者及同期無高尿酸血癥及痛風家族病史的健康體檢者為研究對象，共452例，其中高尿酸血癥188例，男性147例；痛風患者158例，男性153例；健康對照組106例，男性53例。高尿酸血癥均經過臨床及實驗室檢查確診，男性血清尿酸≥416.4 μmol/L，女性血清尿酸≥356.9 μmol/L，且排除明確診斷痛風、腫瘤、腎功能不全、嚴重全身系統性疾病及近期服用過容易引起血尿酸水平上升藥物的患者。痛風患者均符合1997年美國風濕病學會制定的原發性痛風的診斷標準，排除腎臟疾病、腫瘤等引發的繼發性痛風患者。本研究經醫院醫學倫理學委員會批準，所有研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1臨床資料采集、生化指標檢測 分別用抗凝管和分離膠管采集各受試人群空腹靜脈血 3 ml，其中分離膠管采集血液由醫院檢驗科檢測分析肝腎功能及血常規。

1.2.2DNA 提取 取空腹靜脈血EDTA-K2抗凝，3 000 r/min 離心3 min，采用離心吸附柱法，按照TIANamp Blood DNA Kit(天跟公司) 說明書操作提取 DNA，提取的 DNA 樣品用One Drop超微量紫外分光光度計(南京五義科技有限公司)檢測，吸光度(A260/280 nm) 值在 1.5～2.0，濃度 >50 ng/μl的 DNA 樣品用于后續實驗。

1.2.3基因多態性檢測 本實驗采用Hi-SNP結合多重PCR技術和高通量測序技術(上海翼和應用生物技術有限公司)根據 GenBank 中 ABCG2 基因序列，用在線Primer 3.0 軟件設計特異性引物，上游引物序列:5′-CCTTCAGCCACTGAGGAAAAG-3，下游引物序列:5′-ACTCTTTCTTGGGTACTTTAGCTCTA-3′。在單管內進行多重PCR擴增，不同的樣本以不同的Barcode引物區分。混合樣本后，在Ion Proton/illumina 主流測序平臺上，對擴增子進行高通量測序。

2 結果

2.1ABCG2基因rs3114018(A/C)位點的HWE平衡檢驗 結果顯示ABCG2基因的rs3114018位點在各組中均符合Hardy-Weinberg平衡(高尿酸血癥、痛風和健康對照組χ2值分別為0.366、0.005和0.942，P值均大于0.05)，因此樣本具有群體代表性。

2.2臨床資料分析 痛風組和高尿酸組與正常組間三酰甘油和總膽固醇差異均無統計學意義。原發性痛風和高尿酸血癥組血糖、 血肌酐、白細胞、谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶均顯著高于正常組(P<0.05)。而原發性痛風組谷丙轉氨酶、血肌酐、總膽固醇和白細胞與高尿酸組相比有顯著差異(結果見表1～3)。

2.3ABCG2基因rs3114018多態性與痛風和高尿酸易感性的關聯分析 高尿酸血癥組rs3114018 位點AA、AC、CC基因型頻率分別為12.76%、 43.09%、 44.15%；正常組中其基因型頻率分別為15.09%、48.12%、36.79%，兩組基因型比較差異無統計學意義(χ2=1.536，P=0.464)。采用Logtistic回歸比較分析，發現CA和CC基因型均未增加高尿酸血癥患病風險。痛風組ABCG2基因rs3114018位點AA、AC、CC基因型頻率分別為 4.41%、32.70%、62.89%，與對照組基因型頻率分布相比差異有統計學意義(χ2=20.52，P< 0.001)(表4)。采用Logistic回歸比較分析，發現CC基因型使得發生痛風的風險提高了5.861倍(95%CI:2.239～15.340,P<0.001)，其中C等位基因型與痛風發生的相關性為2.461(95%CI:1.671～3.622,P<0.001)。對性別因素進行校正,校正后rs3114018位點CC基因攜帶者痛風發病風險提高了5.540倍(結果見表5)。

2.4ABCG2基因 rs3114018多態性與痛風易感性的關聯分析 rs3114018基因型AA、AC和CC在痛風組和高尿酸血癥組中基因頻率分布存在顯著差異(χ2=14.91，P=0.001)，痛風組C等位基因頻率占79.25%，較高尿酸血癥組差異具有統計學意義(χ2=15.666，P<0.001)。經過分析，rs3114018 CC基因型使痛風的發生風險增加了4.131倍(95%CI:1.695～10.067,P=0.002)，C等位基因能夠使痛風的發病風險增加1.994倍(95%CI：1.413～2.815，P<0.001)，而AC基因型與痛風發生沒有顯著相關性。調整性別影響因素后，差異具有統計學意義(結果見表6)。

表1高尿酸組與正常組臨床資料比較

Tab.1Comparisonofsubjectcharacteristicsofhyperuricemiagroupwithcontrol

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Control20 35±1 5720 24±0 6973 63±1 434 91±0 175 04±0 061 70±0 415 62±0 18Hyperuricemia36 38±1 7427 93±0 9986 73±1 285 16±0 075 38±0 062 09±0 106 35±0 11t6 816 356 421 433 471 323 48P0 0000 0000 0000 1520 0010 1870 001

表2痛風組與正常組臨床資料比較

Tab.2Comparisonofsubjectcharacteristicsofgoutgroupwithcontrol

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Control20 35±1 5720 24±0 6973 63±1 434 91±0 175 04±0 061 70±0 415 62±0 18Gout30 16±1 5426 97±1 25102 09±2 934 83±0 105 63±0 112 18±0 206 99±0 23t4 434 698 710 364 541 104 59P0 0000 0000 0000 7140 0000 2710 000

表3痛風組與高尿酸組臨床資料比較

Tab.3Comparisonofsubjectcharacteristicsofgoutgroupwithhyperuricemiagroups

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Hyperuricemia36 38±1 7427 93±0 9986 73±1 285 16±0 075 38±0 062 09±0 106 35±0 11Gout30 16±1 5426 97±1 25102 09±2 934 83±0 105 63±0 112 18±0 206 99±0 23t2 5250 5675 1352 5161 8890 3742 542P0 0120 5710 0000 0130 060 7090 012

表4高尿酸組、痛風組與正常組ABCG2基因rs3114018位點基因型等位基因頻率分布的比較

Tab.4Comparisonofdistributionofalleleofrs3114018ofgoutandhyperuricemiagroupwithcontrol

GroupsGenotype(n)CCACAAχ2PAllele(ratio)CAχ2PControl395116129(60 85%)83(39 15%)Gout10052720 52<0 001252(79 25%)66(20 75%)21 30<0 001Hyperuricemia8381241 690 430247(65 69%)129(34 31%)1 3790 240

表5ABCG2基因rs3114018多態性與痛風和高尿酸易感性

Tab.5Associationbetweenhyperuricemiaandgoutandgenepolymorphismswithcontrolwhilecontrollingsex

ParameterOR95%CILowerUpperPOR1)95%CI1)LowerUpperP1)HyperuricemiaAC1 0590 5142 1820 8770 9730 4562 0770 943CC1 4190 6782 9680 3531 3400 6192 9040 458AC+CC1 2150 6142 4050 5761 1310 5532 3140 735GoutAC2 3310 8856 1390 0872 0500 6816 1720 202CC5 8612 23915 3400 0005 5401 83416 7350 002AC+CC3 8601 5309 7420 0043 5071 22310 0550 020

Note：1)Adjusted for sex.

表6ABCG2基因rs3114018多態性與痛風易感性的關聯分析

Tab.6Associationbetweengoutandgenepolymorphismswithhyperuricemiawhilecontrollingsex

GnetypeOR95%CILowerUpperPOR1)95%CI1)LowerUpperP1)AC2 2010 8855 4740 0902 1090 8305 3550 117CC4 1311 69510 0670 0024 0491 62610 0840 003AC+CC3 7481 6118 7200 0023 0801 2657 5030 013

Note：1)Adjusted for sex.

3 討論

ATP結合盒蛋白亞家族G成員2(ATP-binding cassette,subfamily G,member 2,ABCG2)是ATP結合盒轉運蛋白家族的一員，基因位于4q22.1，長67 171 bp，編碼655個氨基酸，相對分子量72 343，最早被認識是因其參與了腫瘤細胞的耐藥性產生，因此又被稱為乳腺癌耐藥蛋白(Breast cancer resistance protein BCRP,BCRP)，是導致腫瘤多藥耐藥的重要機制之一[13]，Woodward等[14]研究證實ABCG2作為一種轉運蛋白及尿酸分泌蛋白，廣泛分布在具有分泌和排泄功能的組織。現在多項對 ABCG2 的全基因組關聯研究證實 ABCG2轉運蛋白與體內血尿酸水平和痛風發病率之間存在相關性，其功能紊亂會增加痛風和高尿酸血癥的發病風險[15-17]。Nakayama等[18]研究發現除了性別因素外，基因變異引起的ABCG2功能障礙對高尿酸血癥的發展影響要比其他常見的危險因素如肥胖和酗酒等要大得多。rs3114018是ABCG2基因的單核苷酸多態位點，定位于ABCG2 基因的內含子區域，ABCG2基因rs3114018單核苷酸多態位點對ABCG2基因功能的影響尚不清楚，研究認為雖然內含子區域不直接參與蛋白的編碼，但是其可能通過影響RNA的剪接，從而影響ABCG2蛋白的功能或表達[19]。

近年來研究發現痛風患者rs3114018基因多態性與尿酸水平間存在顯著相關性，攜帶CC基因型的痛風患者尿酸水平明顯高于AA/AC基因型患者[10],Yu等[12]研究發現與正常組相比，C等位基因可能使痛風發病的風險增加。本研究發現ABCG2基因rs3114018位點多態性與恩施地區痛風發病相關，與高尿酸血癥沒有顯著的相關性。痛風組AA、AC、CC基因型與正常組和高尿酸血癥組相比有明顯差異，其中C等位基因型與痛風發生具有相關性，CC基因型攜帶者與對照組相比痛風發生風險提高了5.861倍，與高尿酸組相比痛風發病風險提高了4.131倍。為了去除混雜因素對基因與痛風的影響，調整了痛風組與正常組中性別、血糖、 肌酐、白細胞、谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶等差異因素，發現CC基因型與痛風仍具有相關性(OR=7.505，95%CI：1.884～29.905,P=0.004)；同時調整痛風組和高尿酸血癥組中谷丙轉氨酶、肌酐、血清總膽固醇和白細胞等差異因素后，CC基因型仍然使痛風發病的危險性上升了3.039倍(95%CI:1.064～8.681,P=0.038)。而對比分析高尿酸血癥與正常組發現，兩組基因型比較差異無統計學意義,CA和CC基因型均未增加高尿酸血癥患病風險(P<0.05)，C等位基因也與高尿酸血癥的發生沒有明顯相關性。

由此我們推測ABCG2 rs3114018位點單核苷酸多態性可能與武陵山地區原發性痛風的發病相關，與高尿酸血癥沒有顯著相關性，提示該位點可能成為恩施地區人群痛風篩查的一個遺傳標志。雖然我們發現rs3114018位點與痛風的發生相關，但是并不能解釋其在痛風中的發病機制。另外，考慮到不同種族SNP等位基因頻率不同，以及本研究涉及樣本量相對較少，可能會使結果存在一定的偏差，需要更多的實驗研究來完善。