ECDI偶聯的人抗原提呈細胞誘導供者抗原特異性CD8+ T細胞耐受的實驗研究①

朱漫漫 余玉明 張 華③ 朱 平 劉艷君

(南方醫科大學基礎醫學院免疫學教研室,廣州 510515)

器官移植是終末期器官衰竭最有效的治療方法，移植排斥反應和術后長期服用免疫抑制藥物所致副作用是影響移植患者長期存活的主要障礙[1]。因此，如何在移植患者體內誘導供者抗原特異性免疫耐受，仍是移植學研究的難點和熱點。最近研究顯示，碳二亞胺[1-ethyl-3-(3′-dimethylaminoropyl)-carbodiimde，ECDI]偶聯的小鼠脾細胞(ECDI-coupled splenocytes,ECDI-SPs)成功誘導出小鼠同種和異種移植的供者抗原特異性耐受[2-7]，提示ECDI-SPs在嚙齒類動物移植模型中具有明確、高效的誘導移植耐受作用，但ECDI偶聯人類細胞誘導移植耐受的效果尚不明確。本研究擬通過體外混合淋巴細胞反應(Mixed lymphocyte reaction，MLR)模擬人同種異體移植排斥反應，探討ECDI偶聯的人外周血抗原提呈細胞(ECDI-coupled donor antigen presenting cells,ECDI-APCs)誘導人類外周血T細胞耐受的效果和機制，為將來ECDI-APCs用于誘導人類器官移植免疫耐受提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料與試劑 外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)從健康志愿者外周靜脈血獲得；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品公司；抗人CD2負選磁珠和MS/LS分選柱購自Miltenyi公司；ECDI購自Sigma公司；RPMI1640培養液、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)購自Gibco公司；抗人流式抗體CD4-APC(SK3)、CD8a-APC(SK1)、CD2-FITC(RPA-2.10)、CFSE均購自eBioscience公司；流式細胞儀型號為BD LSRFortessa(BD Biosciences,USA)。

1.2方法

1.2.1志愿者HLA檢測 志愿者HLA由深圳億立方生物技術有限公司測定，根據實驗要求選擇HLA-A、-B和-DR完全錯配的供/受者。根據HLA測定結果，將每3個HLA完全錯配的志愿者設為一組(表1)。

1.2.2人PBMCs的獲取及細胞亞群分離 以EDTA抗凝管采集適量外周血，采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法獲取PBMCs。APCs為PBMCs中去除CD2+細胞后獲得，所分離細胞亞群經流式細胞儀測定純度均在95%～99%。

1.2.3ECDI處理APCs 取ECDI粉劑溶于無菌PBS溶液，根據實驗需要配制成不同終濃度(75、150、500 mg/ml)，過濾除菌。APCs以適量預冷的PBS洗滌1次，4℃，1 700 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀于管底的細胞充分打散后加入新鮮配制的ECDI溶液，使細胞終濃度為3.2×108個/ml，冰上孵育1 h，間斷輕微晃動混勻細胞，以RPMI1640洗3次，調整細胞濃度用于后續實驗。

表1模擬供、受者HLA型別測定結果之一

Tab.1RepresentativeHLAtypingofdonorsandrespon-ders

DonorsandrespondersHLA?A?B?DRB2275(15)71(15)415(2)A26(10)30(19)1361(40)711(5)I124(9)3751(5)910

Note：B.Responder;A.Original priming donor;I.HLA-A，-B，-DR fully mismatched with A and B.This table is one of several groups of volunteers with HLA mismatch.

1.2.4體外混合淋巴細胞反應 以CFSE(0.5 μmol/L)標記的模擬受者(B)PBMCs作為應答細胞(B-PBMCs-CFSE)，ECDI處理的模擬供者APCs為刺激細胞，于96孔U形細胞培養板中進行體外混合淋巴細胞反應，6 d后由原供者(A)或HLA-A、-B、-DR完全錯配的無關供者(I)的APCs作為刺激細胞(A-APCs/I-APCs)，再次加入MLR中，培養8 d后經流式細胞儀檢測受者T細胞增殖情況。

1.2.5受者T細胞增殖情況檢測 采用流式細胞術檢測受者T細胞CFSE的稀釋情況，了解T細胞增殖狀態[8]。流式檢測結果以FlowJo vX.0.7軟件進行分析。

2 結果

2.1體外MLR中供者ECDI-APCs可誘導受者T細胞耐受 ECDI(150 mg/ml)偶聯的模擬供者A的抗原提呈細胞(A-APCs-ECDI)和以CFSE標記的模擬受者B外周血單個核細胞(B-PBMCs-CFSE)按照0.1∶1比例進行體外混合共培養，實驗流程如圖1A所示,-6 d 建立共培養體系，0 d再次加入新鮮分離的模擬供者A-APCs，共培養8 d后檢測模擬受者B的T細胞增殖情況。結果顯示，B-PBMCs-CFSE與A-APCs-ECDI共同孵育6 d后，模擬受者B的CD4+T細胞和CD8+T細胞均未發生明顯增殖(圖1B)；當第0天再次加入模擬供者A-APCs刺激，第8天檢測發現，模擬受者B的CD4+T細胞增殖率(37.6%±18.9% vs 73.1%±6.1%，n=3，P=0.017)和CD8+T細胞增殖率(17.5%±9.7% vs 72.0%±5.4%，n=3，P=0.000)與對照組相比均顯著降低(圖1C)。

2.2ECDI-APCs誘導的CD8+T細胞的耐受狀態具有供者抗原特異性 為進一步了解ECDI-APCs誘導的T細胞增殖抑制或耐受是否具有抗原特異性，A-APCs-ECDI與模擬受者B-PBMCs-CFSE共孵育6 d后，第0天再次分別加入A-APCs或I-APCs作為刺激細胞并培養8 d(圖2A)。結果顯示，A-APCs刺激組中模擬受者B的CD8+T細胞增殖情況明顯低于I-APCs刺激組(12.2%±3.4% vs 32.7%±12.4%，n=3，P=0.035)；CD4+T細胞的增殖率在兩組間無統計學意義(41.2%±18.9% vs 56.6%±11.3%，n=3，P=0.207)(圖2B)。結果提示，供者ECDI-APCs與受者PBMCs共孵育后，可誘導人的CD8+T細胞對異基因個體抗原刺激的耐受性，并且此耐受現象具有供者抗原特異性。

圖1 ECDI-APCs可誘導受者CD4+ 和CD8+ T細胞增殖抑制Fig.1 ECDI-coupled donor APCs treatment could induce responder CD4+ and CD8+ T lymphocytes proliferation inhibition

2.3ECDI偶聯濃度影響ECDI-APCs誘導的耐受效果 本研究對不同ECDI偶聯濃度(75、150、500 mg/ml)下，ECDI-APCs對人類CD8+T細胞耐受誘導的效果進行觀察，結果顯示，ECDI偶聯濃度為150 mg/ml時，A-APCs刺激組受者CD8+T細胞的增殖率明顯低于其他濃度組(ECDI 150 mg/ml組比ECDI 75 mg/ml組為12.2%±3.4% vs 54.0%±7.4%，n=3，P<0.05；ECDI 150 mg/ml組比ECDI 500 mg/ml組為12.2%±3.4% vs 42.2%±18.3%，n=3，P<0.05；圖3)； 并且僅在ECDI濃度為150 mg/ml 時， A-APCs和I-APCs再刺激組CD8+T細胞增殖情況顯示出統計學差異(12.2%±3.4% vs 32.7%±12.4%,P=0.035)，即顯示出供者的特異性耐受(圖3B)。

圖2 ECDI-APCs誘導的受者CD8+ T細胞增殖抑制現象具有抗原特異性Fig.2 Proliferation inhibition of responder CD8+ T cells induced by ECDI-APCs showed antigen specificity

圖3 ECDI偶聯濃度影響ECDI-APCs的耐受誘導效果Fig.3 Different concentrations of ECDI could effect tolerance inducd by ECDI-APCs

3 討論

ECDI是一種常用的工業脫水劑、活化劑，因其具有較好的偶聯作用而廣泛用于肽的合成[9,10]。1979年Miller等[11]第一次報道了ECDI偶聯的小鼠脾細胞(ECDI-SPs)具有誘導自身免疫耐受的能力。最近，Luo等[2]和Bryant等[5]在多種不同移植模型中均成功誘導出針對供者抗原的長期特異性免疫耐受，并證明該耐受誘導方案簡單、高效且無明顯毒性作用，是近幾年出現的極具前景的移植耐受誘導方案[12]。受以上研究啟發，本研究對ECDI處理的人外周血APCs誘導人類供者抗原特異性免疫耐受的可能性進行了探索性研究。

研究結果顯示，ECDI處理的APCs不具有刺激異基因T細胞活化增殖的能力，即可以誘導T細胞無反應性。經ECDI-APCs誘導后的T細胞，無論是CD4+T細胞還是CD8+T細胞亞群，均對再次給予的APCs刺激表現為一定程度的耐受。有趣的是，當再次分別給予來源于原模擬供者或HLA-A、-B、-DR完全錯配的無關供者的APCs刺激時，CD8+T細胞亞群顯示出供者抗原特異性的增殖抑制，而CD4+T細胞并無明顯供者抗原特異性。其具體原因仍不清楚，進一步針對ECDI-APCs誘導下受者PBMCs各細胞亞群表型、增殖、凋亡和細胞因子分泌情況的研究將有助于揭示其內在機制。

最近研究表明，ECDI偶聯濃度對于成功誘導耐受至關重要[13,14]。既往研究中，150 mg/ml是嚙齒類動物實驗中的經典偶聯濃度。除此之外，75 mg/ml和40 mmol/L(490.75 mg/ml，約為500 mg/ml)分別是少數非人靈長類[15]和人類細胞[14]研究中所報道過的最佳偶聯濃度。因此，本研究對不同ECDI濃度偶聯后的人類APCs誘導效果進行了研究。結果表明，不同ECDI濃度偶聯的人類APCs對受者CD8+T細胞有一定耐受誘導作用，但當ECDI偶聯濃度為150 mg/ml時，ECDI-APCs具有明顯的抗原特異性耐受作用。ECDI偶聯人類APCs后，APCs發生凋亡情況，以及ECDI-APCs與模擬受者PBMCs相互作用機制的進一步研究將有助于耐受誘導機制闡釋。

綜上，本研究首次采用ECDI處理的人類APCs在體外模擬異基因移植環境下成功誘導出CD8+T細胞的供者抗原特異性耐受，并且對ECDI最佳處理濃度進行了探討，對ECDI處理的APCs方案用于人類移植免疫耐受誘導的基礎和臨床研究提供了重要實驗依據，進一步探討ECDI在誘導人抗原特異性免疫耐受形成中的效果和相關機制將具有極其重要的意義。