美沙拉嗪通過抑制經典炎性信號通路激活治療噁唑酮誘導的小鼠結腸炎中炎癥反應①

曾建梅 徐 輝

(西南醫科大學臨床醫學院消化內科，瀘州 646000)

炎癥性腸病是一種病因未明的腸道炎癥疾病，主要包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD)[1],UC的病理特征主要以結腸黏膜炎癥和潰瘍形成為主，患者常伴有腹痛腹瀉、膿血便[2]。UC是一種慢性進行性疾病，目前對于UC的發病機制并不明確，可能原因有免疫失衡、環境和外界感染有關[3]。免疫失衡在UC進程及預后中的作用已得到公認[4]，細胞因子的大量釋放進一步加劇了腸道炎癥反應，已有研究證明經典炎癥信號通路NF-κB在炎癥性腸病中處于顯著激活狀態，同時此信號通路調控的下游炎癥因子介質參與疾病的發生與發展[5]。噁唑酮是一種半抗原，可以誘導小鼠接觸部位產生過敏性反應[6]，目前已證明噁唑酮誘導的結腸炎是由IL-4介導的Th2型免疫反應[7]，與臨床UC癥狀相似，可作為理想的人類UC的動物模型，探究藥物治療作用與機制，本研究旨在揭示臨床治療潰瘍性結腸炎一線藥物美沙拉嗪在噁唑酮誘導的UC模型中作用機制。

本研究中我們首次致敏采用3%噁唑酮乙醇溶液涂抹小鼠皮膚，24 h后使用同樣濃度的噁唑酮溶液涂抹小鼠皮膚進行二次致敏，5 d后采用硅膠管經肛門插入小鼠腸道，灌注1%的噁唑酮乙醇溶液誘導小鼠產生UC，選擇經典炎癥信號通路NF-κB及其臨床UC治療一線藥物美沙拉嗪為研究對象。研究美沙拉嗪在治療噁唑酮誘導的小鼠UC中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1動物 于揚州大學比較醫學中心購買60只7～8周齡的BALB/c雌性小鼠，體重26～28 g，按SPF動物飼養要求飼養，自購買之日起適應性喂養1周。

1.2方法

1.2.1造模 結束適應性飼養后小鼠隨機分為對照組、模型組、美沙拉嗪低劑量給藥組和高劑量給藥組，每組15只小鼠。劑量給藥組和所有小鼠在腹部去毛產生2 cm×2 cm大小區域，采用關麗華等[8]的實驗操作方法，第一次致敏：在此無毛區對照組涂抹0.2 ml純乙醇，模型組和給藥組涂抹2 ml 3%的噁唑酮乙醇溶液；第二次致敏：在第一次致敏結束后24 h，所有組小鼠按第一次致敏劑量重復致敏操作；第二次致敏結束5 d后，所有小鼠禁食不禁水24 h，使用10%水合氯醛水溶液按3 μl/g體重腹腔注射麻醉小鼠，對照組小鼠按0.15 ml/g體重使用硅膠管經腸灌注50%乙醇水溶液，灌注結束后倒置小鼠30 s，同時給藥組和模型組小鼠按相等劑量相同操作灌腸1%噁唑酮乙醇(50%)溶液。造模結束后給予小鼠正常飲食和自由飲水。

1.2.2治療 本研究采用治療給藥方式，灌腸造模后分別給予低高劑量給藥組小鼠灌胃100、200 mg/kg 體重的美沙拉嗪0.5%的羧甲基纖維素鈉懸濁液，對照組和模型組分別按體重灌胃相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。每天定時灌胃1次，記錄小鼠體重變化，連續治療7 d。

1.2.3體重變化情況 結束適應性喂養后，整理所有小鼠在造模治療期間體重變化趨勢。

1.2.4結腸病理學損傷程度評估 給藥治療結束后，所有小鼠摘眼球取血后處死。保留小鼠結腸部位做后續研究，切取同一部位結腸進行石蠟包埋和HE染色，在組織學水平綜合評價結腸病理學損傷程度。

1.2.5小鼠機體炎癥反應程度 ELISA法測定小鼠血清中炎癥因子IL-4和IL-13水平，檢測機體Th2型炎癥反應程度。

1.2.6生理生化指標檢測 取小鼠同一部位結腸組織，勻漿后取上清測定組織髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)。

1.2.7小鼠組織NF-κB通路關鍵蛋白表達情況 Western blot法檢測NF-κB信號通路中關鍵調控蛋白的表達水平，研究NF-κB信號通路在噁唑酮誘導的小鼠潰瘍性結腸炎模型中的作用。

2 結果

2.1每組小鼠體重變化比較 小鼠體重是一個直觀表示小鼠機體生長發育水平的關鍵指標，能夠準確反映小鼠生理和病理狀態。模型組小鼠造模后體重明顯下降，同時小鼠活動狀態明顯弱于正常對照組，差異明顯，給藥組小鼠總體體重有所恢復，表明美沙拉嗪在一定程度上有助于改善小鼠UC，結果見圖1。

2.2小鼠結腸組織HE染色 在組織學水平進行石蠟包埋切片之后，HE染色檢測小鼠結腸病變情況以及給藥治療后小鼠結腸組織病變恢復狀態。從結腸形態結構圖可知：模型組小鼠結腸組織基本結構損傷嚴重，隱窩消失，伴有明顯的炎性細胞浸潤。給藥組能夠有效地緩解結腸損傷，能夠明顯恢復小鼠腸道結構。結果見圖2。

圖1 每組小鼠體重變化趨勢Fig.1 Trend of weight change in each group of mice

圖2 小鼠結腸組織HE染色Fig.2 HE staining of colonic tissue in mice

GroupsDose(mg/kg)MPO(U/g) Controlgroup0 77±0 25 Modelgroup2 02±0 721) Lowdosegroup1001 54±0 442) Highdosegroup2001 37±0 622)

Note：Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.001.

表2美沙拉嗪對噁唑酮誘導的結腸炎小鼠血清Th2細胞因子水平的影響

Tab.2EffectofmesalazineonserumTh2cytokinesinoxazoloneinducedcolitismice

GroupsIL?4(ng/L)IL?13(ng/L) Controlgroup46 38±7 62 19 86±3 47 Modelgroup179 67±11 381)52 51±5 371) Lowdosegroup89 42±9 282)31 49±4 662) Highdosegroup93 41±9 652)34 33±5 192)

Note：Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.001.

圖3 美沙拉嗪對小鼠結腸組織經典炎性信號通路關鍵蛋白的影響Fig.3 Effect of mesalazine on key proteins of classical inflammatory signaling pathway in colon tissue of miceNote:1.Control group;2.Model group;3.Low dose group;4.High dose group.

2.3美沙拉嗪對噁唑酮誘導的小鼠結腸炎結腸組織中MPO含量的影響 MPO作為中性粒細胞的產物，可用于評價中性粒細胞浸潤水平。與對照組相比模型組結腸組織MPO顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，給藥治療后小鼠的結腸組織MPO含量顯著下降(P<0.05)。結果見表1。

2.4美沙拉嗪對噁唑酮誘導的結腸炎小鼠血清Th2細胞因子水平的影響 噁唑酮誘導的小鼠UC病癥接近于人UC，屬于Th2型免疫反應。使用ELISA法檢測小鼠血清中Th2型炎癥因子的表達水平。與對照組相比，模型組小鼠血清中IL-4、IL-13水平顯著升高(P<0.05),與模型組比較，給藥治療組小鼠血清中IL-4、IL-13表達顯著下降(P<0.05)，說明美沙拉嗪能在一定程度上抑制Th2型細胞免疫反應。結果見表2。

2.5小鼠結腸組織中NF-κB通路中關鍵蛋白的變化 與對照組相比，模型組小鼠結腸組織中p-p65、p-IκB蛋白的表達顯著增加，同時p65、IκB蛋白的降低，表明在噁唑酮誘導的UC中經典炎癥信號通路處于激活狀態；與模型組比較，各給藥治療組小鼠結腸組織p-p65、p-IκB蛋白下調，說明美沙拉嗪可以抑制NF-κB通路的激活，從而經經典炎癥通路發揮抗炎作用。結果見圖3。

3 討論

UC作為炎癥性腸病中的一大類，其病變主要位于結腸黏膜及黏膜下層，易出現黏膜水腫、糜爛和潰瘍[2]。目前UC發病機制尚未明確，研究者認為其與環境、免疫、遺傳等均具有密切關系[3]。免疫失衡在UC進程及預后中的作用已得到公認[4]，細胞因子的大量釋放進一步加劇腸道炎癥損傷。研究者常利用動物模型模擬人UC[9-11]，探究UC發病機制和藥物干預治療效果和治療機制。噁唑酮作為一種半抗原，能夠誘導小鼠產生過敏反應，最終導致小鼠出現UC癥狀[6]，此種模型類似于人UC，常被用于研究使用。經典炎癥信號通路NF-κB與機體免疫和炎癥密切相關，在其余小鼠結腸炎模型組已驗證其處于顯著激活狀態[5]，這與我們構建的噁唑酮UC模型研究具有相似之處。同時已有報道稱噁唑酮誘導的小鼠UC屬Th2型免疫反應，我們研究發現Th2型細胞因子IL-4、IL-13在噁唑酮模型中處于上調狀態，這與關麗華等[8]的研究一致，證明了噁唑酮模型的有效性和特異性。

本次研究中我們選取了臨床上用于治療UC的一線藥物美沙拉嗪，通過建立有效的動物模型，并且給予不同劑量的藥物治療誘導型結腸炎，通過組織學和生理水平評價機體損傷和抗損傷機制，可以為臨床常用藥物治療結腸炎提供系統有效的系統性實驗資料[12，13]。本研究中采用不同劑量的噁唑酮乙醇溶液經2次皮膚致敏和一次肛門灌腸誘導小鼠產生實驗性結腸炎模型，同時在治療中灌胃給予市售藥物美沙拉嗪，已有研究表明美沙拉嗪可以抑制引起炎癥的前列腺素的合成和炎性介質白三烯的形成,從而對腸黏膜的炎癥起顯著抑制作用[14-16]，同時我們研究發現噁唑酮誘導的UC小鼠結腸組織中經典炎癥信號通路處于顯著激活狀態，同時美沙拉嗪對該通路具有顯著的抑制效果，這有助于治療噁唑酮誘導產生的機體炎性反應，同時美沙拉嗪對于噁唑酮引起的機體免疫失衡具有很好的調節作用，能夠顯著下調血清中Th2型細胞因子水平，進一步說明美沙拉嗪可以通過促進免疫平衡治療潰瘍性結腸炎。