HMGB1及TLR4與Ⅱ型糖尿病及肥胖癥的相關性研究①

劉 帥 王獻春 楊 燦 劉國燕 丁 宇 宋向鳳

(新鄉醫學院第三附屬醫院輸血科，新鄉 453003)

Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)和(Obesity,OB)是與生活方式緊密相連的內分泌代謝性疾病，二者發病機制復雜，至今仍未完全闡明，近年來炎癥反應病因學理論受到廣泛關注，該理論認為，T2DM是一種慢性低度炎癥性疾病，炎癥因子可通過增加胰島素抵抗，促進T2DM的發生和發展；OB患者脂肪組織中的T細胞和巨噬細胞含量明顯增加，二者通過影響前脂肪細胞和脂肪細胞的功能引起炎癥因子表達上調，誘導并參與機體的炎癥反應，因此，肥胖也被認為是一種自然免疫和全身低度慢性炎癥性疾病[1]。

高遷移率族蛋白B1(High mobility group box-1,HMGB1)作為近年來發現的重要新型晚期炎癥介質，是高遷移率族蛋白B家族中唯一可釋放到細胞外并具有細胞因子活性的蛋白分子，可介導多種急慢性炎癥性疾病[2]。前期研究顯示，高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織和外周血中HMGB1表達水平增高，但關于HMGB1及TLR4與T2DM及OB的相關性研究還未見報道，HMGB1及TLR4與T2DM及OB的發生發展是否有關也待進一步研究。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1實驗對象 本次實驗選取2017年1月至8月新鄉醫學院第三附屬醫院內分泌科住院患者以及同期在我院健康體檢中心體檢人員共80例作為研究對象，其中男40例，女40例。根據T2DM診斷標準和口服葡萄糖耐量試驗(Oral glucose tolerance，test，OGTT)結果判斷標準以及OB的診斷標準，按2×2析因實驗設計方法將研究對象分為T2DM-OB組、T2DM-NOB組、NGT-OB組、NGT-NOB組，共4組，每一組為20例，男10例，女10例。4組受檢者的性別構成及年齡間具有均衡性(P>0.05)。

1.1.2實驗試劑 TrizolReagent購自Gibco公司；SYBG Green PCR Master Mix購自ABI公司；PBS緩沖液由新鄉醫學院免疫學研究中心配制；RBC Lysis Buffer(10×)購自上海嶸崴達實業有限公司；異丙醇購自天津博迪化工股份有限公司；三氯甲烷購自煙臺市雙雙化工有限公司；無水乙醇購自天津市德恩化學試劑有限公司；dNTPs、隨機引物、核糖核酸酶抑制劑(RNase inhibitor)、5 × Reverse transcriptase buffer購自TaKaRa；HMGB1 ELISA檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1ELISA 將各濃度標準品液、空白孔液、待測標本均100 μl加入相對應的酶標孔板底部，不要產生氣泡，輕輕混勻，封膜，37℃溫育1 h。甩去孔內液體，加100 μl/孔檢測試劑A，封膜，37℃溫育1 h。加350 μl/孔稀釋洗滌液(1×)，靜置1～2 min，甩去孔內液體，洗板3次，最后一次在吸水紙上拍干。加100 μl/孔檢測試劑B，封膜，37℃溫育30 min。洗板5次。加90 μl/孔底液，換膜封板，37℃避光溫育10～20 min。加終止液50 μl/孔，混勻后即刻在酶標儀450 nm波長處測量各孔光密度值(OD值)。

1.2.2細胞總RNA提取及qPCR 首先利用紅細胞裂解液(10×RBC Lysis buffer)將紅細胞裂解，用Trizol提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，取cDNA2.1 μl、SYBR Select Master Mix 20 μl、引物18.9 μl(由原液稀釋20倍后的工作液)，總體積為41 μl，混勻后每個20 μl分別加樣在1主孔和1副孔，上機進行PCR反應，反應條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min擴增40個循環，以GAPDH作為內參，進行結果分析。Real-time qPCR所用的引物序列見表1。

1.2.3相關生化指標的測定 空腹血糖(Fasting plasma glucose，FPG)、三酰甘油(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein，LDL)等生化指標均在日立7600-020全自動生化分析儀上進行檢測，步驟略。

表1Real-timequantitativePCR引物

Tab.1Real-timequantitativePCRprimers

GeneSequenceprimersTLR4F：5′?CGAGGAAGAGAAGACACCAGT?3′R：5′?CATCATCCTCACTGCTTCTGT?3′GAPDHF：5′?AGAAGGCTGGGGCTCATTTG?3′R：5′?AGGGGCCATCCACAGTCTTC?3′

2 結果

2.1HMGB1濃度在不同組的比較分析 T2DM-OB組濃度高于T2DM-NOB組(P<0.05)，差異具有統計學意義；NGT-OB組濃度高于NGT-NOB組(P<0.05)，差異具有統計學意義；T2DM-OB組濃度高于NGT-OB組(P<0.001)，差異具有顯著統計學意義；T2DM-NOB組濃度高于NGT-NOB組(P<0.001)，差異具有顯著統計學意義，見圖1和表2。

2.2不同組的TLR4表達水平的比較分析 qPCR檢測顯示，T2DM-OB組表達水平高于T2DM-NOB組(P<0.001)，差異具有顯著統計學意義；NGT-OB組表達水平高于NGT-NOB組(P<0.001)，差異具有顯著統計學意義；T2DM-OB組表達水平高于NGT-OB組(P<0.001)，差異具有顯著統計學意義； T2DM-NOB組表達水平高于NGT-NOB組(P<0.001)，差異具有顯著統計學意義，見圖2和表3。

圖1 HMGB1濃度Fig.1 Concentration of HMGB1Note:Compared with T2DM-OB，*.P<0.05，#.P<0.001；compared with NGT-NOB，△.P<0.001，▲.P<0.05.

表2HMGB1濃度

Tab.2ConcentrationofHMGB1

Groupsnχ2SDT2DM?NOB1)3)205399 689622 135T2DM?OB205735 954567 540NGT?NOB204021 379237 031NGT?OB2)4)204297 087469 092

Note：Compared with T2DM-OB，1)P<0.05,2)P<0.001；compared with NGT-NOB，3)P<0.001,4)P<0.05.

2.3HMGB1與各指標的相關性分析 相關性分析結果顯示，HMGB1和TLR4呈正相關(r=0.549，P<0.001)，具有顯著統計學意義，見圖3；HMGB1和BMI(r=0.386)、TG(r=0.621)、FPG(r=0.543)均呈正相關(P<0.001)，而和HDL呈負相關(r=-0.255)，P<0.05， 見圖4～7。以HMGB1為因變量，以性別、年齡、BMI、FPG、TC、TG、HDL和LDL等因素為自變量，擬合多元線性回歸模型，模型的擬合優度R2=0.465,擬合優度較好，自變量對因變量的解釋程度較高。利用方差分析對HMGB1多元回歸分析模型進行檢測，得出回歸模型P<0.001，說明該模型有顯著的統計學意義。通過回歸分析的結果顯示，自變量中只有FPG和TG的回歸系數有統計學意義(P<0.05)，兩指標對HMGB1有預測作用，見表4。

圖2 TLR4表達水平Fig.2 Expression levels of TLR4 Note:Compared with T2DM-OB，*.P<0.001；compared with NGT-NOB，#.P<0.001.

表3TLR4表達水平

Tab.3ExpressionlevelsofTLR4

Groupsnχ2SDT2DM?NOB1)2)204 31601 28902T2DM?OB209 44953 42648NGT?NOB201 55700 39687NGT?OB1)2)203 80051 11379

Note：Compared with T2DM-OB，1)P<0.001；compared with NGT-NOB，2)P<0.001.

圖3 HMGB1和TLR4的相關性(r=0.549,P<0.001)Fig.3 Linear correlation analysis between HMGB1 and TLR4(r=0.549,P<0.001)

圖4 HMGB1和BMI的相關性(r=0.386,P<0.001)Fig.4 Linear correlation analysis between HMGB1 and BMI(r=0.386,P<0.001)

圖5 HMGB1和TG的相關性(r=0.621,P<0.001)Fig.5 Linear correlation analysis between HMGB1 and TG(r=0.621,P<0.001)

圖6 HMGB1和FPG的相關性(r=0.543,P<0.001)Fig.6 Linear correlation analysis between HMGB1 and FPG(r=0.543,P<0.001)

圖7 HMGB1和HDL的相關性(r=-0.255,P<0.001)Fig.7 Linear correlation analysis between HMGB1 and HDL(r=-0.255,P<0.001)

表4HMGB1多元回歸分析

Tab.4MultiplelogisticregressionanalysisofHMGB1

IndexUnstandardizedcoefficientBStd ErrorStandardizedregressioncoefficienttP(Constant)3987 0271096 480-3 6360 001SEX-241 979166 858-0 139-1 4500 151AGE4 5498 5820 0490 5300 598BMI9 05623 1300 0450 3920 697FPG68 77829 0080 2772 3710 020TC-67 827159 813-0 049-0 4240 673TG345 576106 5620 4733 2430 002HDL-121 659231 198-0 052-0 5260 600LDL-50 511184 363-0 029-0 2740 785TLR455 98032 8550 2221 7040 093

Note：Only the regression cofficients of FPG and TG were statistically significant(P<0.05)，and the two indicators have predictive effect on HMGB1.

3 討論

HMGB1是高遷移率族蛋白家族的重要一員，傳統觀點認為HMGB1是低分子量的非組蛋白染色體蛋白質，但近年研究發現，核內的HMGB1可由免疫細胞在應對感染、損傷或其他炎癥刺激時主動或被動地釋放至胞外，作為一種炎性細胞因子發揮重要作用[3]。HMGB1一旦被釋放到細胞外，通過結合受體，誘導活化核因子(Nuclear factor，NF)-κB轉位，致使炎性細胞因子分泌，從而引發炎癥免疫反應[4]。TLRs作為HMGB1的受體是公認的促進炎癥的先天免疫受體，尤其是TLR4，可以通過機體內毒素的激活，進而引起核因子的活化以及炎性細胞因子的釋放[5，6]。

T2DM和OB是嚴重危害人類健康、影響生活質量的常見疾病，近年來的研究表明T2DM和OB不僅是代謝性疾病，而且是一種與炎癥有關的疾病，促炎細胞因子的過度表達與T2DM和OB有著緊密的聯系[7]。對T2DM和OB患者的研究表明：白細胞計數、C反應蛋白(C reactive protein，CRP)和炎性細胞因子的表達水平增加引起系統性炎癥和脂質的積累，最終導致肥胖、胰島素抵抗等代謝綜合征疾病[8，9]。目前大多數學者認為T2DM和OB是一種慢性低度炎癥性疾病，慢性低度炎癥是T2DM和OB的中心環節。

本實驗將HMGB1濃度在T2DM-OB組與NGT-OB組、T2DM-NOB組與NGT-NOB組分別進行比較，結果顯示前者的HMGB1濃度均顯著高于后者(P<0.001)，這一實驗結果表明糖代謝紊亂可以增加HMGB1的濃度。實驗研究發現，腎小管上皮細胞在高血糖的刺激下釋放HMGB1并結合、活化TLR4[10]。最近的動物實驗研究表明，Ⅰ型糖尿病小鼠血清HMGB1濃度與對照組相比表達水平顯著升高[11]。將TLR4表達水平在T2DM-OB組與NGT-OB組、T2DM-NOB組與NGT-NOB組分別進行比較，前者的表達水平均顯著高于后者(P<0.001)，進一步將HMGB1濃度與TLR4表達水平進行相關性分析發現二者呈明顯的正相關(P<0.001)，說明HMGB1及TLR4對T2DM具有明顯的影響，在患T2DM后HMGB1及TLR4的表達水平會明顯升高；相關性分析顯示HMGB1濃度與FPG呈正相關(P<0.001)，通過回歸分析發現FPG對血漿HMGB1的表達水平有預測作用，說明HMGB1與機體是否糖耐量異常存在密切的關系。根據這次實驗結果以及相關實驗證據得出：HMGB1通過結合TLR4誘導胰島細胞凋亡及胰島素抵抗并進一步促進T2DM的發生與發展。

本實驗我們將HMGB1濃度在T2DM-OB組與T2DM-NOB組、NGT-OB組與NGT-NOB組分別進行比較，結果顯示前者濃度均大于后者(P<0.05)，證明HMGB1濃度與肥胖癥存在一定的關系。Guzman-Ruiz等[12]研究表明肥胖患者血漿HMGB1水平增加但脂肪組織中mRNA水平降低，據此他們得出一個結論：脂肪組織不是HMGB1誘導炎癥的主要促進者。隨后的實驗研究顯示皮下脂肪組織分泌HMGB1增加，但皮下脂肪組織HMGB1的分泌量與血漿含量沒有相關性(r=0.10，P=0.58),HMGB1表達水平的這種差異被認為是炎癥觸發來源于脂肪組織的脂肪間質細胞，后者進一步分泌HMGB1，而成熟脂肪細胞對HMGB1的分泌沒有促進作用[13，14]。本實驗通過將TLR4表達水平在T2DM-OB組與T2DM-NOB組、NGT-OB組與NGT-NOB組分別進行比較發現，前者的表達水平均高于后者(P<0.05)；HMGB1濃度與TLR4表達水平進行相關性分析發現二者呈正相關(P<0.001)，說明HMGB1及TLR4對肥胖癥有影響，在患OB后HMGB1及TLR4的表達水平明顯升高，這一實驗結果表明：HMGB1介導的脂肪組織炎癥反應極有可能是通過TLR4途徑發揮作用。有研究指出，HMGB1通過結合TLR4引起NF-κB核易位從而誘導促炎細胞因子和黏附分子的轉錄并最終導致炎癥的發生[15]。本次實驗相關性分析還發現HMGB1表達水平與TG、BMI呈正相關(P<0.001)，進一步回歸分析提示TG對HMGB1有一定的預測功能，這表明HMGB1表達水平受脂質代謝的影響。有實驗研究表明在囊性纖維化糖尿病患者發病期間HMGB1表達水平的增加與糖尿病患者的BMI有關[16，17]。

綜上所述，通過對T2DM和OB患者HMGB1及TLR4表達水平的檢測發現：T2DM及OB患者體內HMGB1、TLR4的表達水平明顯增高，HMGB1表達水平與糖脂代謝紊亂存在相關性，HMGB1與TLR4結合后通過相應的途徑參與T2DM及OB的病理生理發展過程。