胎盤蛋白14增強調節性T細胞誘導濾泡調節性T細胞比例增加的作用及機制研究

林麗慧 陳 瑾 唐 梅

(海南西部中心醫院婦產科，儋州 571700)

不明原因復發性流產(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)是引起繼發不孕的重要因素，免疫系統功能異常是引起URSA的主要原因之一[1]。調節性T細胞(Treg細胞)是機體的重要免疫抑制細胞，能夠通過分泌免疫抑制因子，抑制機體異常細胞免疫反應[2]。大量的研究發現URSA的發生與患者體內Treg細胞數量減少有緊密關系，Treg細胞移植可以有效治療機體免疫系統對自體組織器官的異常攻擊[3-5]。濾泡調節性T細胞(Tfr細胞)是體液免疫的主要抑制細胞，最新的研究發現Treg細胞能促進Tfr細胞的增殖[6]。因此Treg細胞被認為是URSA主動免疫治療的重要靶標。胎盤蛋白14(PP14)是一種子宮內膜合成的糖蛋白，在維持妊娠中發揮著重要作用[7]。研究發現PP14具有顯著的免疫抑制作用，協助胎盤的免疫豁免[8]。然而PP14對Treg細胞的影響及其進一步調控Tfr細胞目前國內外還未見報道。

1 材料與方法

1.1試劑 PP14購于Abcam公司；人淋巴細胞分離液購于天津TBD公司；RPMI1640基礎培養基和胎牛血清購于Hyclone公司；CD4、CD25、CXCR5、Foxp3、CTLA-4和HLA-G流式抗體購于BD公司； IL-10和TGF-β的ELISA試劑盒購于欣博盛生物科技公司；IL-10和TGF-β中和抗體購于Abcam公司；Treg細胞分選試劑盒購于BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞分離和培養 收集健康獻血志愿者的外周血，將其與PBS進行1∶1混合，之后緩緩加入到淋巴細胞分離液的上層，2 000 r/min離心 20 min，用吸管吸取白膜層，PBS清洗3次后，置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養。

1.2.2Treg細胞的檢測 淋巴細胞分離后分兩組，對照組和PP14組(培養基中加入10 μg/ml的PP14[9])，置于細胞培養箱中培養48 h后，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，之后加入CD4、CD25、CTLA-4和HLA-G的抗體，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次后破膜，加入Foxp3抗體，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次后流式檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的比例及其表面CTLA-4和HLA-G的表達。

1.2.3Treg細胞分選 我們采用試劑盒中的磁珠分選淋巴細胞中Treg細胞。人淋巴細胞分離液分離出外周血中的淋巴細胞，之后置于15 ml離心管中，加入4 ml PBS重懸；通過間接法標記出帶有磁性的非CD4+T細胞，同時加入PE-CD25抗體；將離心管置于磁力架上，靜置5 min后，吸取上層的細胞，置于另一個離心管中；加入抗PE的磁珠，室溫孵育1 h，之后將離心管置于磁力架上，靜置5 min后，棄上清；PBS反復清洗3次后將分離出的Treg細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養。

1.2.4ELISA檢測 實驗分組同前，PP14刺激 48 h后，使用Treg細胞分選試劑盒分選出Treg細胞，繼續培養48 h，收集培養上清，2 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用ELISA方法檢測上清中IL-10和TGF-β的濃度，操作嚴格按照說明書進行。

1.2.5共培養實驗 我們采用Transwell小室進行Treg細胞和淋巴細胞的共培養實驗。實驗分為幾組：對照組(單純的淋巴細胞)、共培養組(上室為對照組淋巴細胞中分選的Treg細胞，下室為淋巴細胞)和PP14組(上室為PP14組淋巴細胞中分選的Treg細胞，下室為淋巴細胞)，共培養48 h后，收集下室的細胞，加入CD4和CXCR5的抗體，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次后破膜，加入Foxp3抗體，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次后流式檢測淋巴細胞中CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細胞的比例。

2 結果

2.1PP14促進Treg細胞比例的升高 流式的結果顯示對照組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的比例為(0.060 97±0.008 94)%，PP14組Treg細胞的比例為(0.137 30±0.013 37)%，兩組之間差異具有顯著的統計學意義(t=4.748，P=0.009 0)，這說明PP14可以促進Treg細胞比例的增加，增強機體的免疫抑制能力。見圖1。

2.2PP14對Treg細胞表面的免疫抑制分子沒有顯著作用 流式結果顯示對照組CTLA-4和HLA-G的平均熒光強度分別為62.23±4.134和7.550±1.078，PP14組分別為62.47±5.705和8.227±1.097，兩組之間沒有顯著的統計學差異(t=0.108，P=0.918 6；t=0.439，P=0.682 8)，這些結果說明PP14對Treg細胞表面的免疫抑制分子沒有顯著作用。見圖2。

2.3PP14促進Treg細胞分泌免疫抑制分子 ELISA的結果顯示對照組Treg細胞培養上清中IL-10和TGF-β的濃度分別為(6.663±1.181)ng/ml和(1.400±0.379)ng/ml，PP14組的濃度分別為(31.070±3.380)ng/ml和(6.800±0.608)ng/ml，兩組差異均具有顯著統計學差異(t=6.817，P=0.002 4；t=7.537，P=0.001 7)。這些結果說明PP14可以促進Treg細胞分泌免疫抑制分子，進一步促進免疫抑制功能的發揮。見圖3。

圖1 PP14促進Treg細胞比例的升高Fig.1 PP14 increased proportion of Treg cellsNote:n=6,VS control,*.P<0.05.

圖4 PP14增強Treg細胞誘導Tfr細胞比例增加的作用Fig.4 PP14 enhanced proportion of Tfr cells induced by Treg cellsNote:n=6,VS control,*.P<0.05;VS co culture group,#.P<0.05;VS PP14 group,△.P<0.05.

圖2 PP14對Treg細胞表面的免疫抑制分子沒有顯著的作用(n=6)Fig.2 PP14 had no significant effect on immunosupp-ressive molecules of Treg cells(n=6)

圖3 PP14促進Treg細胞分泌免疫抑制分子Fig.3 PP14 promoted Treg cells to secrete immunosuppr-essive moleculesNote:n=6,VS control group,*.P<0.05.

2.4PP14增強Treg細胞誘導Tfr細胞比例的增加 共培養實驗的結果顯示對照組CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細胞比例為(0.044 0±0.007 94)%，共培養組比例為(0.213 3±0.056 08)%，兩組之間差異具有顯著的統計學意義(t=2.990，P=0.040 3)；PP14能夠增強Treg細胞誘導Tfr細胞比例的增加，相對于共培養組，PP14組CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細胞比例增加了2.71倍，差異具有顯著的統計學意義(t=4.815，P=0.008 6)；IL-10和TGF-β的阻斷均能部分阻斷這種增強作用，相對于PP14組，IL-10和TGF-β阻斷組CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細胞比例分別下降了69.20%和56.54%，差異均具有顯著統計學意義(t=4.868，P=0.008 2；t=3.670，P=0.021 4)；我們進一步同時加入IL-10和TGF-β的阻斷抗體，共同阻斷組CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細胞比例為(0.092 33±0.036 01)%，與共培養組相比，沒有顯著的統計學差異，這說明PP14增強Treg細胞誘導Tfr細胞比例增加主要是通過IL-10和TGF-β介導的。見圖4。

3 討論

復發性流產在育齡期女性的發生率約為1%～5%,其中40%～60%原因不明,稱為不明原因復發性流產(URSA)。免疫功能異常是引起URSA的重要原因，調節機體的免疫系統對于URSA的治療至關重要[10]。Treg細胞是維持機體免疫耐受的重要細胞，在妊娠期可以有效抑制母體對胎兒的同種異體免疫排斥反應，維持正常的妊娠。大量的研究表明URSA的發生與孕婦體內Treg細胞比例下降緊密相關，增加Treg細胞比例可能是治療URSA的很有發展前景的方法[3-5]。PP14是一種胎盤蛋白，具有顯著的免疫抑制作用[11]。我們的研究發現PP14能夠誘導Treg細胞的增殖，促進Treg細胞分泌免疫抑制分子，進而可能在調控URSA異常免疫反應中發揮著顯著的治療作用。B細胞介導的體液免疫在URSA的發生和發展中同樣發揮著關鍵性的作用。Tfr細胞是體液免疫的負向調節細胞，能夠通過抑制Tfh細胞和IL-21的分泌，而抑制B細胞增殖和分化為漿細胞[12]。Treg細胞與Tfr細胞緊密相關，Treg能夠通過細胞表面抑制性分子或者分泌免疫分子，誘導Tfr細胞的增殖[13]。我們的研究發現PP14能夠顯著增強Treg細胞誘導Tfr細胞比例的增加，IL-10和TGF-β在其中可能發揮著關鍵性的作用。通過中和性抗體抑制Treg細胞分泌的IL-10和TGF-β，能夠顯著降低Tfr細胞的比例。

綜上，我們的研究發現PP14能夠通過IL-10和TGF-β通路，顯著增強Treg細胞誘導Tfr細胞比例的增加。在后續的實驗中，我們將進一步研究在URSA患者體內Treg細胞和Tfr細胞之間的相關作用，為URSA的治療提供了一個新的靶點。