痛瀉安脾湯對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠5-HT和NPY蛋白表達的影響

馬 軍 宋雨鴻 張麗華

廣州市第一人民醫院中醫科，廣東廣州 510180

腸易激綜合征（IBS）是一種以腹痛或腹部不適為特征的腸道功能紊亂的慢性疾病。我國IBS發病率為5%[1]，而腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是臨床上較為常見的類型。中醫認為IBS-D多屬于肝失疏泄、肝郁脾虛、脾氣漸虛范疇[2]。國內外資料顯示，IBS-D患者多伴有焦慮、煩躁、抑郁等植物神經功能紊亂癥狀，精神狀態可影響IBS-D發病及病情進展，這與中醫肝郁脾虛學聯系密切。5-羥色胺（5-HT）是一種參與腦-腸軸的重要神經介質，而神經肽Y（NPY）是一種腦腸肽，具有神經遞質和激素雙重功能的多肽，5-HT和NPY在IBS-D發病中起重要作用[3-4]。本研究采用痛瀉安脾湯干預IBS-D模型大鼠，了解其對5-HT和NPY含量的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF級SD大鼠40只，體重為280～300g，雄雌各20只，購于廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物中心動物合格證號：0093643。動物及實驗條件均符合國家科學技術委員會制定《實驗動物管理條例》。動物飼養于醫院清潔級實驗動物房，動物房恒溫恒濕，溫度控制在20～25℃之間，食物和飲水由動物自由攝取。動物購回后飼養2周適應實驗環境后方開始實驗研究。

1.2 主要試劑及儀器

顯微鏡、恒溫水浴箱、冷凍干燥機、低溫自動平衡離心機，NPY和5-HT ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。

1.3 藥物制備

痛瀉安脾湯提取液：薏苡仁、白芍、黨參、茯苓、防風、炒白術、陳皮、烏藥、當歸、白扁豆、石菖蒲、甘草、全蝎，按10∶ 10∶ 5∶ 5∶ 5∶ 5∶ 3.3∶3.3∶ 3.3∶ 3.3∶ 3.3∶ 2∶ 1比例稱取適量藥材，以10倍70%乙醇加熱提取2次，每次時長2h，過濾并合并濾液，減壓蒸餾回收乙醇，并調整質量濃度為含生藥1.5g/mL。鹽酸洛哌丁胺膠囊（河南中杰藥業有限公司，H20003271）內容物溶于0.9%氯化鈉注射液，調配成濃度為0.108g/mL，保存在4℃冰箱待用。

1.4 造模

采用番瀉葉灌胃瀉下法加束縛應激刺激復制大鼠模型。造模大鼠以調配好濃度為200%番瀉葉溶液，按20mL/kg劑量灌胃。每次灌胃后1h，使用透明膠帶束縛大鼠肩部、胸部及前肢，限制前肢抓搔面部，使其出現煩躁，不限制其余活動，束縛時間約2h。持續造模2周。空白組在此期間以生理鹽水灌胃，且不給予任何束縛干預。以體重變化、腹瀉率、腹瀉指數等為主要指標評價造模效果。造模后模型組大鼠體重增加緩慢、腹瀉率達到100%，腹瀉指數明顯增加，同空白組比較，差異有統計學意義，提示造模成功。

1.5 給藥

造模2周后，模型組、鹽酸洛哌丁胺組和痛瀉安脾湯組仍按造模方案灌胃番瀉葉溶液，灌胃1h后，模型組以生理鹽水灌胃，鹽酸洛哌丁胺組給藥劑 量 1.08g/（kg·d），給 藥 體 積 20mL/（kg·d），痛瀉安脾湯組給藥劑量30g/（kg·d），給藥體積20mL/（kg·d）。灌胃1h后，給予束縛干預2h。空白組大鼠全程給予等量生理鹽水灌胃，且不給予任何束縛干預，每日1次，連續2周。

1.6 指標檢測

末次給藥24h后，以10%水合氯醛皮下麻醉大鼠，取腹主動脈血液，離心分離血清待用，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清神經肽Y（NPY）、5-羥色胺（5-HT）含量。取血后，迅速取出大鼠下丘腦組織和一段長度約2cm的結腸組織，制成長度約1cm標本。下丘腦、結腸組織經常規脫水、包埋、切片、二甲苯脫臘后乙醇水化，抗原修復后分別加入一抗（1∶ 100）4℃過夜，PBS洗3次，滴加生物素化山羊抗大鼠IgG，孵育20min，PBS洗3次，滴加SABC試劑，孵育30min，再以PBS洗3次。DAB顯色劑室溫顯色，鏡下控制反應時間，蘇木精復染，脫水、透明、封片，以400倍顯微鏡觀察。

1.7 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件處理分析數據，定量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清5-HT和NPY含量比較

模型組大鼠血清5-HT和NPY含量均較空白組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；鹽酸洛哌丁胺組和痛瀉安脾湯組大鼠血清5-HT和NPY含量均較模型組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；痛瀉安脾湯組大鼠血清NPY含量降低幅度較鹽酸洛哌丁胺組大，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 痛瀉安脾湯對大鼠腸道中5-HT表達的影響

模型組大鼠回盲部和結腸遠端5-HT陽性細胞數量顯著較空白組增多，免疫組化染色強度顯著增強，差異有統計學意義（P＜0.05）；痛瀉安脾湯組和鹽酸洛哌丁胺組大鼠回盲部和結腸遠端5-HT陽性細胞數量和染色強度均與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；痛瀉安脾湯組和鹽酸洛哌丁胺組大鼠回盲部和結腸遠端5-HT陽性細胞數量均較模型組減少，免疫組化染色強度明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 各組血清5-HT和NPY含量比較

表2 痛瀉安脾湯對大鼠腸道中5-HT表達的影響

2.3 痛瀉安脾湯對大鼠下丘腦、結腸組織NPY蛋白表達影響

模型組大鼠下丘腦和結腸組織NPY蛋白表達均明顯較空白組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；痛瀉安脾湯組和鹽酸洛哌丁胺組大鼠下丘腦、結腸組織NPY蛋白表達均較模型組上調，且痛瀉安脾湯組大鼠下丘腦、結腸組織NPY蛋白表達上調幅度較鹽酸洛哌丁胺組大，差異有統計學意義（P ＜ 0.05），見表 3。

3 討論

中醫學認為，IBS-D屬于痛泄、泄瀉及大腸泄等范疇，與肝脾密切相關。其發病機制尚不完全清除，目前認為主要與內臟感覺、腸道功能紊亂、精神心理因素等有關[5]。胃腸道是體內唯一經中樞神經、自主神經和腸神經共同支配的系統，機體通過腦-腸軸的神經內分泌網調節胃腸功能。經腦-腸軸聯系中樞神經系統、腸神經系統和胃腸道反應細胞實現腦腸互動[6]。腦腸肽具有激素和神經遞質雙重功能，5-HT、NPY、P物質、促腎上腺皮質激素等主要腦腸肽與IBS-D發病密切相關[7-8]，5-HT對胃腸道的蠕動和分泌具有主要的調節作用，可對內臟敏感性和胃腸動力造成影響，中樞和外周5-HT異常表達可誘發IBS癥狀[9-10]。

表3 痛瀉安脾湯對大鼠下丘腦、結腸組織NPY蛋白表達影響

痛瀉安脾湯是根據痛瀉要方和參苓白術散進行加減而成，方中黨參補益脾胃之氣，白術、茯苓健脾滲濕，以培土瀉木，共為君藥。白芍酸苦，微寒，《神農本草經》謂其：“主邪氣腹痛……止痛，利小便，益氣。”其柔肝緩急以止痛；當歸甘辛苦溫，養血活血，使血和則肝和，血充則肝柔，共為臣藥，君臣配伍可于土中瀉木。薏苡仁、白扁豆健脾滲濕，可資健脾止瀉之力，共為佐藥。陳皮、烏藥辛溫，理氣燥濕，醒脾和胃，為佐藥。防風具升散之性，合白芍以助疏散肝郁；伍白術以鼓舞脾之清陽，并可祛濕以助止瀉；又為脾經引經藥，故兼具佐使之用。全蝎辛平，入肝經，與防風同用以祛風通絡、解痙止痛，共為佐藥。并佐以石菖蒲燥濕運脾，寧神止痛；甘草補脾和中而調和諸藥，為佐使藥。諸藥相伍，具有補脾柔肝、祛濕止瀉、行氣活血、解痙止痛之功效。本研究結果顯示，痛瀉安脾湯能有效的降低IBS-D大鼠血清5-HT和NPY含量，這可能與痛瀉安脾湯能改善胃腸功能，并通過腦-腸軸聯系中樞神經系統和腸神經系統反饋信息，減少5-HT和NPY生產和釋放[11-12]。本研究結果顯示，痛瀉安脾湯能有效降低IBS-D大鼠結腸組織的回盲端和遠端5-HT表達，給予痛瀉安脾湯能有效的改善模型大鼠腹瀉和腹脹等癥狀，降低腸道高敏性，使腸道動力紊亂得以改善，可能使腸道微循環血流增加，腸道黏膜炎癥反應減輕，從而緩解腹瀉、腹脹等癥狀。結果還顯示，痛瀉安脾湯能有效的上調下丘腦和結腸組織中NPY表達，可能與痛瀉安脾湯能減輕焦慮、煩躁、抑郁等神經癥狀有關，在中樞神經系統中NPY及其受體調節痛覺具有重要作用，腸道中NPY結合腸黏膜神經節周圍行乙酰轉移酶，從而對腸道蠕動發揮抑制作用，或是中樞中作用于下丘腦和海馬抑制應激和穩定情緒[13-15]，從而改善IBS-D大鼠腹瀉癥狀。

綜上所述，痛瀉安脾湯可能通過降低腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠血清5-HT、NPY水平，降低腸道5-HT表達，上調模型大鼠下丘腦和腸道NPY蛋白表達而改善腹瀉癥狀。