五氯柳胺混懸液中抗氧化劑焦亞硫酸鈉含量測定

白玉彬，董 朕，張吉麗，周緒正，張繼瑜

（中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

五氯柳胺（Oxyclozanide）屬于水楊苯胺類藥物，是一種氧化磷酸化解偶聯劑，可降低寄生蟲體內三磷酸腺甙（ATP）的合成量，從而導致蟲體因能量代謝紊亂而最終死亡［1］，該藥對吸蟲、絳蟲和線蟲均具有活性。為滿足獸醫臨床的需求，本實驗室自主研發了五氯柳胺口服混懸劑，采用焦亞硫酸鈉作為五氯柳胺混懸液的抗氧化劑，以提高制劑的穩定性［2－5］。在溶液中焦亞硫酸鈉會產生二氧化硫，從而生成亞硫酸鹽對動物造成損害，控制焦亞硫酸鈉的含量對提高產品的安全性具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent cary 100 UV－Vis （Agilent Technologies）；KQ－600DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPT－Ⅱ－40L優普超純水制造系統（上海優普實業有限公司）；賽多利斯SQP電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］。

1.2 試劑

無水亞硫酸鈉 （天津市濱海科迪化學試劑有限公司）；酸性品紅（國藥集團化學試劑有限公司）；冰乙酸（天津恒興試劑）；結晶乙酸鈉（天津市北辰方正試劑廠）；乙二胺四乙酸二鈉（天津市大茂化學試劑廠）；五氯柳胺混懸液（實驗室自制，批號20171102、20171103、20171104）。

1.3 溶液配置

1.3.1 酸性品紅溶液的配制 精密稱量酸性品紅0.34 g，加入1 mL硫酸，加水稀釋并定容至1 000 mL。

1.3.2 醋酸鹽緩沖液（pH=4.8）的配制 稱取結晶乙酸鈉 136.1 g，乙二胺四乙酸二鈉 0.4 g，加入冰乙酸57 mL。加水溶解并定容至1 000 mL。

1.3.3 0.04%乙二胺四乙酸二鈉溶液的配制 精密稱量乙二胺四乙酸二鈉0.4 g，加水溶解并定容至1 000 mL。

1.3.4 無水亞硫酸鈉對照品溶液的配制 精密稱量無水亞硫酸鈉10 mg，加入0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋并定容至50 mL，配制成200 μg/mL作為儲備溶液。精密量取儲備溶液適量，依次使用0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋為100、80、60、50、40、30、20 μg/mL 的對照品溶液。

1.3.5 供試品溶液的配制 精密量取1 mL五氯柳胺混懸液于100 mL容量瓶中，加入適量0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液，超聲溶解，加0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液定容至100 mL。

1.3.6 輔料干擾溶液的配制 精密量取1 mL不含焦亞硫酸鈉的五氯柳胺混懸液于100 mL容量瓶中，加入適量0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液，超聲溶解，并定容至100 mL。

1.4 測定方法的建立

1.4.1 檢測波長的選擇 精密量取酸性品紅溶液2mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共4份，分別加入醋酸鹽緩沖液1 mL（空白溶液）、輔料干擾溶液1 mL、50 μg/mL無水亞硫酸鈉對照品溶液1 mL、供試品溶液1 mL，加醋酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻。以醋酸鹽緩沖液為參比，在200～800 nm進行掃描。

1.4.2 反應時間的選擇 精密量取酸性品紅溶液2mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，加入50 μg/mL無水亞硫酸鈉對照品溶液1 mL，加醋酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻。室溫下放置5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 min， 測定上述溶液在548 nm處的吸光度，選擇吸光度穩定的時間作為反應時間。

1.4.3 專屬性試驗 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共2份，分別加入醋酸鹽緩沖液1 mL（空白溶液）和輔料干擾溶液1 mL，加醋酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻。室溫下放置45 min，分別在548 nm處測定吸光度。測得空白溶液和輔料干擾溶液的吸光度，觀察輔料是否會對測定結果產生影響。

1.4.4 標準曲線 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共7份，分別加入 100、80、60、50、40、30、20 μg/mL 的對照品溶液，加醋酸鹽緩沖液定容，搖勻，室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比，測定上述溶液在548 nm處的吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度的倒數為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.5 重復性試驗 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共6份，分別加入供試品溶液，加醋酸鹽緩沖液定容，搖勻，室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比，測定上述溶液在548 nm處的吸光度。計算RSD，RSD不得大于2%。

1.4.6 回收率試驗 精密稱取4、5、6 mg無水亞硫酸鈉于100 mL容量瓶中，加入0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液定容，搖勻，配制成 40、50、60 μg/mL 的對照品溶液。精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共3份，分別加入上述配制好的 40、50、60 μg/mL 的對照品溶液，加醋酸鹽緩沖液定容，搖勻，室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比，測定上述溶液在548 nm處的吸光度。計算平均回收率及RSD。

1.5 樣品含量測定

精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，分別加入3批五氯柳胺混懸液供試品溶液，加醋酸鹽緩沖液定容，搖勻，室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比，測定上述溶液在548 nm處的吸光度，按照標準曲線法計算3批樣品中的焦亞硫酸鈉含量。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

在200～800 nm處對空白溶液、輔料干擾溶液、對照品溶液、供試品溶液進行掃描，結果顯示最大吸收波長為548 nm（圖1至圖4）。

圖1 空白溶液掃描圖譜

圖2 輔料干擾溶液掃描圖譜

圖3 對照溶液掃描圖譜

圖4 供試品溶液掃描圖譜

2.2 反應時間的選擇

分別以 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 min作為顯色時間測定吸光度 （表1）。由表1可知，在0～25 min吸光度變化明顯，而在40～60 min吸光度較穩定，故選擇45 min作為反應時間。

2.3 專屬性試驗

在548 nm處測得空白溶液和輔料干擾溶液的吸光度均為0.875，表明處方中的輔料成分不干擾焦亞硫酸鈉含量的測定。

2.4 標準曲線

分別在548 nm處測定一系列對照品溶液的吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度的倒數為縱坐標，繪制標準曲線（圖5），得標準曲線方程為y=0.023 c＋0.868，R2=0.992。

2.5 重復性試驗

按照供試品溶液配制方法配制6份樣品溶液，在548 nm處測定吸光度（表2）。由表2可知，RSD為0.055 775%，證明其重復性較好。

2.6 回收率試驗

在 548 nm 處測定 40、50、60 μg/mL 對照品溶液的吸光度 （表3）。由表3可知，平均回收率為97.09%，RSD 為 0.641 1%，證明該方法準確度高。

2.7 含量測定結果

按照上述焦亞硫酸鈉測定方法，對3批五氯柳胺混懸液中的焦亞硫酸鈉含量進行測定，結果見表4。從表4中可以看出，3批樣品中的焦亞硫酸鈉的含量均接近3.4 mg/mL，說明五氯柳胺混懸液性質穩定。

表1 不同顯色時間溶液的吸光度

圖5 標準曲線

表2 重復性試驗結果

表3 回收率試驗結果

表4 3批樣品含量測定結果

3 小結與討論

肝片形吸蟲是寄生于肝臟膽管內所引起的一種較常見的人獸共患寄生蟲病，該病分布廣泛，在中國各地都有發生［6－8］，然而對于驅吸蟲的藥物研究與開發，近年來一直沒有突破性進展。臨床使用的藥物，例如三氯苯達唑、氯氰碘柳胺等均已產生耐藥性［9，10］。五氯柳胺作為一種抗肝片吸蟲藥，對于五氯柳胺的耐藥性國內外還未見報道。五氯柳胺混懸劑研制成功，將對中國動物寄生蟲病的防治發揮積極作用，尤其將改變中國在動物吸蟲病防控中缺乏有效藥物的局面，對促進畜牧業健康發展、保障公共衛生安全具有重要意義。焦亞硫酸鈉作為五氯柳胺混懸液的抗氧化劑，能夠有效降低五氯柳胺混懸液的氧化作用，使其含量保持穩定，使制劑能夠達到長期儲存的目的。但焦亞硫酸鈉在溶液中會產生二氧化硫，從而生成亞硫酸鹽，從而對動物造成損害，通過對抗氧化劑焦亞硫酸鈉的含量測定，對于五氯柳胺的新藥研發、應用以及食品安全控制具有重要的意義。

在反應時間的選擇試驗中，文獻［2，4］中反應時間均在25 min，而本研究發現中，在25 min時，吸光度仍不穩定，證明酸性品紅溶液中亞硫酸鈉未能完全反應，而在45 min測定的溶液吸光度達到穩定狀態，證明亞硫酸鈉反應完全，所以將反應時間定為45 min。同時對樣品溶液的加入量進行了篩選，固定酸性品紅溶液為 2 mL， 分別加入 0.5、1.0、2.0、3.0 mL樣品溶液，在548 nm處測定吸光度，結果發現，當樣品加入量為 1.0 mL 時，吸光度在 0.2～0.8，測得的誤差較小，所以將樣品加入量定為1.0 mL。

在方法學驗證中，連續對6份供試品溶液進行測定，測得吸光度RSD為0.055 775%，證明該方法重復性好；標準曲線為 y=0.023c＋0.868，R2=0.992，線性關系好；平均回收率為 97.09%，RSD 為 0.641 1%，證明該方法準確度高。通過分析方法結果驗證來看，該方法專屬性強、準確度高、線性關系好，可用于五氯柳胺混懸液中抗氧化劑焦亞硫酸鈉含量的測定。