褐藻多糖體外免疫調節活性研究

李俊燕　孫可澄　辛泉伯　羅薇　宋悅凡

摘要：以甘露糖醛酸多糖和巖藻聚糖硫酸酯為實驗材料，通過酸水解法得到不同的聚甘露糖醛酸組分；采用超聲法對巖藻聚糖硫酸酯進行降解，收集不同分子量范圍區間的組分，對各樣品進行紅外光譜分析，并考察了體外對RAW264.7細胞活力的影響，以探索各組分的體外免疫調節活性。實驗結果表明，采用三氟乙酸對甘露糖醛酸多糖進行水解，其紅外譜圖與水解前有明顯變化，出現酯基吸收峰，表明水解程度較高；而醋酸水解后紅外吸收譜圖峰型無顯著變化；采用凝膠排阻層析進行分子量檢測，各組水解后的聚甘露糖醛酸分子量有不同程度降低。巖藻聚糖硫酸酯經超聲處理后，分子量>100kD的組分在2μg/mL濃度下具有提高RAW264.7活性的作用，而濃度上升至54、162μg/mL時對細胞活性有抑制作用；而水解后所得的聚甘露糖醛酸各樣品對RAW264.7活性無顯著影響。

關鍵詞：聚甘露糖醛酸；巖藻聚糖硫酸酯；免疫調節；生物活性

全世界海洋中生長有15000余種海藻，海洋藻類植物十分豐富。多糖是海藻最重要的產物，約占其干重的50%以上。海藻多糖是一種高分子碳水化合物，由多個不同或相同的單糖基通過糖苷鍵相連而成，并且它也是一種具有調節機體免疫功能作用的天然的活性物質，它通過調節機體免疫系統功能可以增強機體免疫活性，另外還具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗輻射和抗凝血等作用。

免疫系統是一套復雜的調控網絡，在控制感染、預防慢性疾病和腫瘤的形成中發揮核心作用，具有免疫調節活性的天然產物的開發日益受到重視。廣泛存在于動物、植物和微生物中的多糖是具有免疫調節活性的天然產物的重要來源，能夠參與機體多種生理過程的調節，具有安全、毒副作用小等特點。本次實驗旨在探索褐藻多糖的免疫調節活性，為未來的褐藻多糖功能產品的開發奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1生物材料 甘露糖醛酸多糖及巖藻聚糖硫酸酯由大連海洋大學食品科學與工程學院，國家海藻加工技術研發分中心提供；RAW 264.7細胞由中國科學院大連化學物理研究所提供。

1.1.2試劑 R/MINI 1640培養基，胎牛血清，青霉素，鏈霉素，二甲基亞砜（DMSO），胰酶購自上海生工。冰醋酸，三氟乙酸（TFA），四甲基偶氮唑鹽（MTT），溴化鉀，無水乙醇，三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為市售分析純。

1.2方法

1.2.1酸解法制備褐藻膠聚甘露糖醛酸 分別稱取50mg甘露糖醛酸多糖6份，配制8.5mol/L醋酸溶液，4m01/L三氟乙酸溶液，加樣如表1所示。搖勻，放人70℃電熱恒溫鼓風干燥箱水解4h后，取出，冷卻至室溫，4℃過夜后，將樣品放人70℃電熱真空干燥箱中，使溶劑揮發，加入去離子水，搖勻，再次放人70℃電熱真空干燥箱中揮發，重復2～3次，pH試紙檢測約為6.0，取出備用。

1.2.2超聲法制備不同分子量區間的巖藻聚糖硫酸酯 稱取80mg日本厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯于50mL離心管中，加入去離子水20mL，搖勻，用超聲波細胞粉碎機進行超聲，超聲波粉碎機設定強度為99%，溫度為50℃，超聲波工作時間4s，間隔9s，總時長60min。將超聲后的樣品依次轉入100kD、50kD超濾管中，9000r/min，離心20min，收集分子量>100kD和100～50kD多糖組分，冷凍干燥，備用。

1.2.3各組分紅外光譜檢測 稱取經干燥后的褐藻多糖樣品1.8～2.8mg，分別加入溴化鉀，烘干至恒重后，研磨均勻，壓片后經傅立葉變換紅外光譜儀（PerkinElmer股份有限公司）掃描4000～450cm^-1波數范圍。

1.2.4凝膠排阻層析法測定褐藻多糖的分子量 使用AKTA（UPC10）系統，采用Sephacryl S-100填料，色譜柱直徑1cm，高度36cm，流動相為8mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=8.0），分別稱取褐藻多糖樣品2～3mg，溶于Tris-HCl緩沖液，得濃度為2mg/mL的褐藻多糖溶液，上樣，檢測各樣品的出峰位置。測定分子量所用的標準品分別為藍色葡聚糖（分子量>2000kD）和葡萄糖標準品（分子量分別為5、40、70kD）。流動相流速為0.3mL/min，記錄外水體積V。和洗脫體積V_e2，以Kav為橫坐標（K_av=（V_e-V_o）/（V-V_o）），葡萄糖標準品分子質量對數為縱坐標，建立標準曲線，根據標準曲線計算褐藻多糖的分子量。

1.2.5MTT測定褐藻多糖對小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7活性的影響 選取RAW264.7細胞使用R/MINI-1640培養基培養，各培養基均加入10%小牛血清。取細胞株對數期生長細胞，使用培養基調整細胞濃度至2×10₅個/mL，96孔板每孔接種100μL，待96孔板中細胞接種約4h貼壁后，加入含多糖樣品的培養基100μL，使得各多糖組分的終濃度分別為2、6、18、54、162μg/mL，同時設置只加入培養液的空白對照組，置于含5%CO₂的培養箱中，37℃培養18h后，各孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，孵育4h后棄上清，加入150μLDMSO裂解，使用酶標儀雙波長測定各孔吸光值，檢測波長570nm、參比波長630nm。以對照組OD值為100%細胞活力，計算多糖樣品各濃度下的細胞活力，采用t一檢驗法，P值取0.05時，與對照組比較不同多糖對RAW264.7細胞活力的影響是否顯著。

2結果與分析

2.1聚甘露糖醛酸和巖藻聚糖硫酸酯組分的制備

酸解制備的聚甘露糖醛酸樣品，經過多次加入去離子水，真空干燥，最終樣品均為黑褐色固體，pH值約為6。超聲粉碎凍干后的巖藻聚糖硫酸酯，分子量區間>100kD的樣品重量為5.2mg，分子量區間在100～50kD的樣品重量為2.3mg。兩種組分總回收率為9.4%。

2.2聚甘露糖醛酸組分的紅外光譜分析

初始的甘露糖醛酸多糖樣品紅外光譜圖如圖1所示，6種經降解后的聚甘露糖醛酸樣品的紅外光譜圖，如圖2-圖3所示。

未經酸解的甘露糖醛酸多糖在3310cm^-1處出現O-H伸縮振動的吸收峰，為多糖的一OH特征吸收峰，在1616cm^-1處出現酰胺基C=O伸縮振動吸收峰，在1414cm^-1處出現C-H變角振動吸收峰，在1030cm^-1處出現C-O-C、C-O-H伸縮振動吸收峰。

經1、2、4mol三氟乙酸降解后所得的聚甘露糖醛酸均表現為相似的出峰位置，其中包括在3369～3402cm^-1處出現O-H伸縮振動的吸收峰，為多糖的-OH特征吸收峰，在1685cm^-1處出現C=O伸縮振動的吸收峰，存在部分內酯，在1416cm^-1處出現C-H變角振動，在1040～1085cm^-1處出現C-O-C、C-O-H伸縮振動吸收峰。

經2.125、4.25、8.5tool醋酸水解后所得的聚甘露糖醛酸均表現為相似的出峰位置，其中包括在3341～3350cm^-1處出現O-H伸縮振動吸收峰，為多糖的-OH特征吸收峰，在1615cm^-1處出現酰胺基C=O伸縮振動吸收峰，在1414cm^-1處出現C-H變角振動吸收峰，在1035cm^-1處出現C-O-C、C-O-H伸縮振動吸收峰。

對比原樣品與降解后的樣品發現：三氟乙酸水解后的聚甘露糖醛酸樣品都在1685cm^-1處出現羧基的吸收峰，峰值偏1700cm^-1，有部分酯基，存在部分內酯，說明樣品水解程度高。醋酸水解的聚甘露糖醛酸樣品與水解前樣品相似，說明醋酸的水解作用弱。同種酸不同濃度水解的樣品紅外譜圖相似，說明在該水解溫度和作用時長條件下，酸濃度對水解程度的影響較為有限。

2.3不同聚甘露糖醛酸降解組分的分子量檢測

將不同的聚甘露糖醛酸進行凝膠排阻層析，依據葡萄糖標準品測定其各自的分子量，所得結果如下：初始甘露糖醛酸多糖樣品分子量為22.72kD；以1、2、4mol三氟乙酸水解的聚甘露糖醛酸分子量分別為6.91kD、8.58kD、7.17kD；以2.125、4.25、8.5mol醋酸水解的聚甘露糖醛酸分子量分別為14.83kD、11.51kD、11.87kD。可知：經三氟乙酸水解后的聚甘露糖醛酸分子量較小，水解的較為徹底；而經醋酸水解后的聚甘露糖醛酸分子量較大。

2.4各多糖組分體外對RAW264.7細胞活力的影響

6種經降解后的聚甘露糖醛酸樣品對RAW264.7細胞活力的影響結果，如圖4-圖5所示。6種聚甘露uW264.7細胞活力無明顯影響，并無體外免疫細胞活性調節作用。

分子量>100kD的巖藻聚糖硫酸酯對RAW264.7細胞活力的影響結果，如圖6所示。分子量>100kD的巖藻聚糖硫酸酯樣品的濃度在2、54、162g/mL時，與對照組相比有顯著性差異，2μg/mL濃度時顯著刺激細胞活力上升，54、162μg/mL顯著抑制細胞活性，說明分子量>100kD的巖藻聚糖硫酸酯體外具有免疫調節作用，在低濃度下對RAW264。7細胞活力有促進作用，而在高濃度下對RAW264.7細胞活力有抑制作用。50～100kD的巖藻聚糖硫酸酯樣品與對照組相比無顯著性差異。

3討論

褐藻多糖雖然在組成和化學結構上存在差異，但在生物活性方面有很多的相似性，2013年，李海花等觀察研究了重均分子量為5.5kD的低聚甘露糖醛酸對小鼠免疫系統的作用，結果表明，低聚甘露糖醛酸能提高機體的細胞免疫和體液免疫水平，具有顯著的免疫調節作用。而本實驗采用體外RAW264.7細胞培養，結果表明，聚甘露糖醛酸在體外條件下對免疫細胞并沒有刺激或抑制作用，表明多糖在體內和體外免疫調節活性考察時，可能出現不同結果。

2016年，劉曉東等研究了巖藻聚糖硫酸酯對小鼠免疫的影響，結果表明，褐藻多糖硫酸脂在小鼠體內能不同程度地誘導細胞因子的產生，促進細胞免疫反應。本實驗分子量>100kD的巖藻聚糖硫酸酯對細胞活力有顯著性影響，低濃度下有提高細胞活性的作用，高濃度則起到抑制作用，故巖藻聚糖硫酸酯具有免疫調節活性，結果與劉曉東等研究結果相似。聚甘露糖醛酸的體內免疫調節活性和巖藻聚糖硫酸酯免疫調節活性的機理值得進行深入研究和探索。

（收稿日期：2017-12-05）