17種植物提取物對大豆疫霉的抑制作用

◎ 許 敏，馬林昊，劉凡巧，高 劍，馬冠華

（西南大學植物保護學院，重慶 400715）

大豆疫霉根腐病于1989年首次在中國東北地區發現并于1991年被公開報道[1]，該病害對大豆生產具有毀滅性損害[2]。目前，該病已經上升為大豆主產區黑龍江省大豆生產中對產量為害最大的病害。大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）可侵染大豆生長發育的各階段，尤其是種子和幼苗階段，會導致種子腐爛，幼苗根、莖基部腐爛或出現水浸狀或立枯并變紅褐色，最終引起植株萎蔫、死亡[3-4]。

植物源農藥是來源于植物體的農藥，其有效成分通常不是單一化合物，而是植物有機體中的多種甚至大部分有機物質[5]，具有低毒、低殘留、環保友好、不破壞生態環境、靶標有害生物對其不易產生抗藥性、對非靶標生物安全、活性成分的作用方式特異等特點，在有機農業領域得到廣泛應用[6-7]，目前，已經有多種植物源活性成分的農藥取得登記并成功應用，如2.5%魚藤酮乳油、0.5%楝素乳油等[6]。

甲霜靈是有效防治大豆疫霉根腐病的殺菌劑之一，但由于甲霜靈作用位點單一，大豆疫霉菌易對其產生抗藥性[8]。筆者利用菌絲生長速率法測定了包括青蒿琥酯、百里酚、肉桂醛、8-甲氧基補骨酯素在內的17種植物提取物對大豆疫霉的作用效果，來尋找可代替甲霜靈等化學藥劑的植物提取物。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

大豆疫霉野生型菌株P7076，抗甲霜靈突變體Me3-7-3（2 739.81倍 ）、Me9-7-2（4 527.93倍 ）、Me7-3（9 764.4倍），抗丁吡嗎啉突變體Py4-7-2（115.77倍）、Py4-7-3（500.24倍），由西南大學植物生態病理研究所提供。

1.2 供試植物提取物、試劑及材料

青蒿琥酯（99%）、百里酚（≥99%）、肉桂醛（99%）、8-甲氧基補骨酯素（99%），購自上海泰坦科技股份有限公司。5,5-二烯丙基-2,2’二苯基二醇（97%）、β-細辛醚（≥95%）、乙酸丁香酚酯（≥98%）、黃獨素B（≥95%）、蛇床子素（≥98%）、香芹酚（99%）、異丁香酚（97%）、4-異丙基苯甲醛（98%）、1,2,3-三苯酚（99%）、楊梅素（97%），購自北京伊諾凱科技有限公司。黃藤素（97%）、α-細辛醚（99%），購自上海麥克林生化科技有限公司。黃酮（99%），購自百靈威科技有限公司。V8蔬菜汁，市售，由美國Campbell公司生產。

1.3 母液的制備

取0.1 g或100 μL植物提取物溶于適量的二甲基亞砜中，配制成104μg/mL母液，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.4 培養基的制備

10%V8培養基：100 mL V8蔬菜汁、900 mL ddH2O、10 g CaCO3、20 g瓊脂。115 ℃高壓滅菌21 min。

1.5 植物提取物對病原菌菌絲生長抑制活性的測定

采用菌絲生長速率法[9]。用無菌水將104μg/mL母液稀釋成適宜的濃度，在培養基中加入一定量的藥劑，配成相應濃度的含藥培養基，充分搖勻，倒入直徑為6 cm的培養皿中，每皿10 mL，以等量無菌水配成無藥培養基平板作為空白對照，每個濃度3次重復。將供試菌株于25 ℃下黑暗培養4 d，用直徑為5 mm的打孔器在靠近菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，然后將菌餅菌絲面朝下接種到各平板中央，并在25 ℃下黑暗培養4 d后，用十字交叉法測定各個處理的菌落生長直徑。按照下面公式求出各個藥劑濃度對菌絲生長的抑制率。

最后將藥劑的濃度轉化為對數（x），抑制率轉化為機率值（y），根據x與y的線性關系求出毒力回歸曲線方程y=a+bx、相關系數R、有效抑制中濃度EC50。

2 結果與分析

2.1 17種植物提取物對大豆疫霉野生型菌株的抑制作用

17種植物提取物對大豆疫霉野生型菌株P7076的菌絲生長均有一定的抑制作用，厚樸酚的抑制作用最佳，其EC50值為17.032 5 μg/mL。其中，EC50值在50 μg/mL以下的有厚樸酚、香芹酚、黃藤素、百里酚和1,2,3-三苯酚5種；EC50值在50～100 μg/mL的有異丁香酚、肉桂醛、黃酮、青蒿琥酯、黃獨素B和乙酸丁香酚酯6種，EC50值在100～200 μg/mL的有楊梅素、α-細辛醚、蛇床子素、8-甲氧基補骨酯素和β-細辛醚5種；17種植物提取物中，效果最差的是枯茗醛，其EC50值為201.803 0 μg/mL，見表1。

表1 17種植物提取物對大豆疫霉野生型菌株P7076菌絲生長的抑制作用表

2.2 17種植物提取物對大豆疫霉抗甲霜靈突變體的抑制作用

厚樸酚對抗甲霜靈突變體菌絲生長的抑制作用最佳，3株抗性菌株的EC50值分別為14.879 2、17.294 0和14.427 7 μg/mL，其中厚樸酚、香芹酚、青蒿琥酯、黃酮、黃藤素、百里酚、1,2,3-三苯酚、異丁香酚、8-甲氧基補骨酯素、肉桂醛的EC50值在10～65 μg/mL，乙酸丁香酚酯、楊梅素、黃獨素B、α-細辛醚、蛇床子素、β-細辛醚的EC50值在95～160 μg/mL，抑制效果較好；效果最差的是枯茗醛，3株抗性菌株的EC50值分別為505.779 7、402.447 6、326.589 9 μg/mL。經統計分析表明，17種植物提取物對3株抗甲霜靈突變體的抑制作用無顯著性差異，即抑制作用與抗性倍數無相關性，見表2。

表2 17種植物提取物對大豆疫霉抗甲霜靈突變體的抑制作用表

2.3 17種植物提取物對大豆疫霉抗丁吡嗎啉突變體的抑制作用

厚樸酚對抗丁吡嗎啉突變體菌絲生長的抑制作用最佳，2株抗性菌株的EC50值分別為13.941 9、14.785 4 μg/mL，其中厚樸酚、香芹酚、青蒿琥酯、黃酮、黃藤素、百里酚、1,2,3-三苯酚、異丁香酚、8-甲氧基補骨酯素、肉桂醛的EC50值在10～50 μg/mL，乙酸丁香酚酯、楊梅素、黃獨素B、α-細辛醚、蛇床子素、β-細辛醚、枯茗醛的EC50值在90～190 μg/mL，抑制效果都較好。經統計分析表明，17種植物提取物對2株抗丁吡嗎啉突變體的抑制作用無顯著性差異，即抑制作用與抗性倍數無相關性，見表3。

表3 17種植物提取物對大豆疫霉抗丁吡嗎啉突變體的抑制作用表

2.4 野生型菌株與抗性菌株之間抑制作用的比較

通過比較17種植物提取物對3種類型的大豆疫霉菌株之間的抑制作用發現，青蒿琥酯、黃酮和8-甲氧基補骨酯素3種提取物對野生型菌株P7076的EC50值顯著高于抗性菌株的EC50值，即這3種提取物對抗性菌株的抑制作用更好（表4），其余14種植物提取物對野生型菌株和兩種藥劑的抗性菌株抑制作用無明顯差異。

表4 野生型菌株與抗性菌株之間抑制作用的比較表

3 討論

植物是生物活性化合物的巨大天然寶庫，植物中產生的次生代謝產物超過40萬種，其中許多次生化學物質具有殺蟲或抑菌的生物活性，在農業上有著重要的研究價值[10]。目前，國內外對植物提取物對病原菌抑制作用的研究非常活躍[11-12]。有的植物提取物甚至可以直接用于一些農作物病害的防治[13]。研究發現，青蒿琥酯、蛇床子素和厚樸酚對荔枝霜疫霉菌均有用于開發防治荔枝霜疫霉的植物源農藥的潛力，對荔枝霜疫霉菌菌絲生長抑制作用中，厚補酚的EC50值約為31 μg/mL，青蒿琥酯的EC50值約為133 μg/mL，蛇床子素的EC50值約為138 μg/mL[14]；本試驗對大豆疫菌絲生長的抑制測定發現，厚補酚的EC50值約為15 μg/mL，青蒿琥酯的EC50值約為41 μg/mL，蛇床子素的EC50值約為120 μg/mL，說明厚樸酚、青蒿琥酯和蛇床子素相較于荔枝霜疫霉對大豆疫霉的抑制效果更好。百里酚與香芹酚是同分異構體，研究發現其對褐腐菌的菌絲擴展和孢子萌發均具有較好的抑制能力[15]，本試驗中百里酚對大豆疫菌絲生長的抑制作用的EC50值約為40 μg/mL，說明百里酚對大豆疫霉也有較好的防治效果。

本試驗發現，除枯茗醛外的16種植物提取物對大豆疫霉野生型菌株和兩種藥劑的抗性菌株均有較好的抑制作用，其EC50值均低于200 μg/mL，對于3種類型的菌株，抑制效果最好的是厚樸酚，EC50值約為15 μg/mL，其次是香芹酚，EC50值約為23 μg/mL，均低于常用藥劑霜霉威對大豆疫霉的菌絲生長抑制作用的EC50值[16]，表明厚樸酚和香芹酚具有開發為植物源農藥的潛力。另外，青蒿琥酯、黃酮和8-甲氧基補骨酯素3種植物提取物對野生型菌株的EC50值顯著高于抗性菌株的EC50值，即這3種提取物對抗性菌株的抑制作用更好，是否由于抗藥突變體的突變位點與該植物提取物的作用位點一致還需要進一步研究。

本試驗測定了17種植物提取物對大豆疫霉的菌絲生長的抑制效果，要全面評估這些植物提取物的開發價值，還需要測定其對游動孢子囊產量、卵孢子產量等方面的影響，更全面地說明這些植物提取物的抑制作用。同時，目前雖然不少關于植物提取物的抑制作用研究報道，但大多數仍然停留在實驗室水平，真正應用于農作物病害防治的比較少[17-20]。因此，還需要對這些植物提取物進行田間應用效果測試，以為植物源農藥的開發應用提供依據。