鱷魚腸中一株乳酸菌分離鑒定及活性物質的初步分析

◎ 張小玉，鄧素娥

（東莞出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，廣東 東莞 523000）

乳酸菌是一群能利用可發酵碳水化合物主要產乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱[1]，主要包括乳桿菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）等屬。乳酸菌一般被視作是安全的，甚至可以改善人體和動物的健康，歷來被用作食品的天然生物防腐劑。本文從鱷魚腸道中分離得到1株潛在乳酸菌，對其活性物質進行初步研究，為進一步篩選微生物的天然抑菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 分離樣品

鱷魚腸。

1.2 指示菌

用于抗菌活性的指示菌：大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌和黑曲霉，均購買于廣東微生物所。

1.3 培養基

MRS培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂18.0 g和天然海水1 000 mL，pH6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min，用于乳酸菌的培養純化。

改良MRS培養基：在MRS培養基的基礎上加0.3%CaCO3[2]，用于乳酸菌的分離篩選。

MRS液體培養基：用于乳酸菌的發酵。

營養瓊脂培養基：蛋白胨20 g、牛肉浸出粉5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min，用于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的培養。

加3% NaCl營養瓊脂培養基：蛋白胨20 g、牛肉浸出粉5 g、氯化鈉35 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min，用于副溶血性弧菌的培養。

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養基：胰酪胨15.5 g、植物蛋白胨5.0 g、氯化鈉5 g、酵母粉6.5 g、瓊脂15.0 g和蒸餾水1 000 mL，pH 7.1～7.5，121 ℃滅菌20 min，用于單核細胞增生李斯特氏菌的培養。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：馬鈴薯粉6.0 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，用于黑曲霉的培養。

1.4 乳酸菌的分離篩選

無菌操作，用滅菌海水沖鱷魚腸表面2～3次，晾干水分，在無菌工作臺稱25 g樣品，用滅菌剪剪碎后加入到裝有225 mL無菌水的錐形瓶中（瓶中預先放一定數量的小波珠），振動搖晃30 min，即為稀釋度10-1的樣品液，吸取10-1稀釋液1 mL加到盛有9 mL滅菌海水的試管內，搖勻，制成10-2稀釋液，同樣方法，稀釋到10-3、10-4。用移液槍分別吸取各稀釋樣液100 μL到改良MRS培養基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，于30 ℃恒溫培養48 h。挑選周圍溶鈣圈較明顯的單菌落，在MRS固體培養基中純化培養，反復劃線，直至獲得純的單菌落。用接種環挑取純化單菌落于1.5 mL滅菌離心管里，加入1 mL 20%甘油，然后在渦旋器上渦旋30 s，待菌充分分散，于-20 ℃冰箱中保存，備用，共分離4株。

1.5 菌株E02分類學地位鑒定

1.5.1 形態學鑒定

將篩選出的菌株接種于MRS培養基上，30 ℃恒溫培養48 h。觀察固體培養基上菌落的形狀、顏色等特征。挑取菌體進行革蘭氏染色，用普通光學顯微鏡觀察染色結果。

1.5.2 生理生化反應測定

按照東秀珠[3]的方法，對菌珠E02進行生理生化試驗。

1.6 抑菌活性物質初步分析

1.6.1 菌株E02發酵液制備

用接種環挑取1環單菌落于MRS液體培養基中，37 ℃靜置發酵培養48 h，然后在10 000 r/min離心20 min[4]，得到發酵上清液，用酸度計測定發酵液的酸度，并記錄。

1.6.2 乳酸對照液制備

將MRS液體培養基用1 mol/L的乳酸調至與原發酵上清液相同pH值，即為對照液。

1.6.3 指示菌菌懸液制備

指示菌菌懸液制備采用光電比濁計數法，在含有指示菌的斜面上加入適量無菌生理鹽水，在渦旋器上充分渦旋，制成高濃度的菌懸液，再移入50 mL的大試管中，加入適量的無菌生理鹽水進行稀釋，用分光光度計（波長為600 nm）測OD值，使菌懸液的OD值為0.5，然后按每100 mL冷卻至50 ℃左右的指示菌培養基接種1 mL OD值為0.5的指示菌懸液。

1.6.4 牛津杯雙層平板法[5]測抑菌活性

2.0 %的素瓊脂冷至50 ℃左右，按每平皿7 mL傾倒在無菌平皿中，待凝固后，用無菌鑷子取2個已滅過菌的牛津杯擺放在倒有素瓊脂的平皿中，再傾倒含有指示菌的培養基，待凝固后，用鑷子拔去牛津杯。在其中一個牛津杯的孔中加入約200 μL無細胞發酵上清液，另外一個牛津杯的孔中加入對照液，在4 ℃冰箱中擴散4 h，置于適宜的培養條件下培養一定時間后觀察是否有抑菌圈，并測量其大小，抑菌圈越大，代表該菌株抑菌能力越強。

大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和單核細胞增生李斯特菌37 ℃培養12 h，黑曲霉28 ℃培養48 h。

1.6.5 原發酵上清液與相同pH對照液抑菌活性的比較

對比原發酵上清液與相同pH對照液的抑菌圈大小，對抑菌活性進行初步分析。

2 結果與分析

2.1 菌株E02分類學地位鑒定

2.1.1 形態學鑒定

菌株E02菌落呈圓形上凸狀、光滑、白色、濕潤，邊緣較整齊。菌株E02為短桿、無芽孢的革蘭氏陽性菌，其顯微形態如圖1所示。

圖1 菌株E02的顯微形態圖

2.1.2 生理生化鑒定

菌株E02最適合生長溫度為30 ℃，其生理生化特征見表1。菌株E02經過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、產硫化氫實驗、吲哚實驗均呈陰性。通過東秀珠編著的《常見細菌鑒定手冊》比對，菌株E02初步鑒定為乳桿菌。

表1 菌株E02生化鑒定特征表

2.2 抑菌活性物質初步分析

由表2可知，菌株E02既可抑制革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和副溶血性弧菌）又可抑制革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和單核細胞增生李斯特菌），但對真菌（黑曲霉）并沒有抑菌作用。

由表2和表3對比可知，說明抑菌作用是酸和非酸性物質共同作用結果，其主導抑菌作用主要來源于其產生的酸，只有少部分是其他活性物質。

表2 菌株E02原發酵上清液的抑菌圈直徑表（單位：mm）

表3 乳酸對照液抑菌圈直徑表（單位：mm）

3 討論

改良MRS培養基，在MRS培養基的基礎上加0.3%CaCO3，此條件下分離到菌落出現溶鈣圈的現象，有利于乳酸菌的分離篩選，CaCO3是一種很好的指示劑。

該實驗成功地從鱷魚腸道中分離到1株對常見食品腐敗菌具有抑菌活性的菌株，菌株E02既可抑制革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和副溶血性弧菌）又可抑制革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和單核細胞增生李斯特菌），但對真菌（黑曲霉）并沒有抑菌作用。

通過用乳酸調節與原發酵液相同pH的MRS液體培養基，并與原發酵液作抑菌活性對比，排除乳酸作用，菌株E02發酵液仍然具有抑菌效果。在以后實驗中，希望能進一步的研究，確定它們是何種物質。