一種霉菌和酵母菌的快速檢測研究

◎ 扶 勝，顏躍躍，周 繪，周 艷

（貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴陽 貴州 550009）

霉菌和酵母菌均屬真菌，廣泛存在于空氣、水和土壤中，種類繁多，具有很強的新陳代謝能力。霉菌可引起食物霉變，不僅影響食物外觀和風味，而且攝入量過多會刺激人體消化道，導致腸胃不適，甚至引起疾病發生[1]。在適宜條件下，霉菌能夠產生有毒的代謝產物——霉菌毒素，造成食物中毒并有致癌作用[2]，危及生命安全。酵母菌能夠在低pH、低水活性、低濕度、高鹽或高糖的食品中生長[3]，是引起這類食品腐敗變質的主要菌株[4]，給食品工業帶來了巨大的安全隱患[5]。

目前，我國已在飲品類、堅果類及米面制品類食品中將霉菌和酵母菌作為常見指示菌進行檢測和控制，將其列入GB 4789.15-2010[6]系列食品安全微生物常規檢測項目。關于食品中霉菌和酵母菌的檢測，現行的檢測技術也依賴于該標準，檢測方法為平板法，是經典的微生物檢測和鑒定方法，檢測結果準確可靠，但耗時長且操作繁瑣，難以滿足快速檢測的需求。2007年，PetrifilmTM測試片被正式列入中國出入境檢驗檢疫行業標準，試紙片法彌補了平板法的缺陷，逐步成為微生物檢測和鑒定的主要方法。近年來，關于霉菌和酵母菌快速檢測試紙片的研究已有報道[7-8]，但這些方法均需要涂布和蓋膜操作，引入人為操作不當導致判讀結果有誤的可能。本試驗的開展，就是為了盡可能地簡化實驗操作步驟，提高試紙片對霉菌和酵母菌的檢測效率，以獲得可靠的檢測結果，為霉菌和酵母菌的快速檢測提供可靠的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、孟加拉紅、氯霉素、N,N-二甲基甲酰胺、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和氯化硝基四氮唑藍。

電熱恒溫鼓風機、智能恒溫恒濕箱、高壓滅菌鍋、菌落計數器、精密pH計、電子分析天平、移液器、超低溫冰箱和超凈工作臺。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

（1）霉菌和酵母菌特征顯色液體培養基制備。稱取胰蛋白胨0.8～2.0 g、酵母粉0.4～0.8 g、葡萄糖1～4 g、磷酸氫二鉀0.05～0.1 g、氯化鈉0.05～0.2 g、磷酸二氫鉀0.2～0.4 g、硫酸鎂0.2～0.4 g、孟加拉紅0.04～0.1 g置于燒杯中，用蒸餾水定容至100 mL，加熱溶解后，用高壓滅菌鍋在121 ℃下滅菌15 min，冷卻至室溫后依次加入經過過濾滅菌的1～3 mL 0.1 g/mL的氯霉素及0.015～0.040 mL酶底物混合劑，得到液體培養基，在0～4 ℃下冷藏備用。

（2）酶底物混合劑制備。取2 g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和1 g氯化硝基四氮唑藍，溶解于100 mL N,N-二甲基甲酰胺中。

1.2.2 測試片的制備

（1）濾紙片前處理。采用直徑為70 mm的白色中速濾紙，用1.0～1.5 mL 0.05 mol/L Triton-Tris的緩沖生理鹽水處理后，置于37 ℃恒溫箱中干燥4 h后取出，放入含有干燥劑的自封袋中，室溫保存備用。

（2）培養液吸附。取上述處理的濾紙片，121 ℃滅菌15 min后浸入培養基中浸泡5～10 min。取出后平放在已滅菌的超凈工作臺中，無菌條件下烘干，置于0～4 ℃的無菌冷藏箱內保存備用。

（3）組裝。將上述得到的試紙片裝入無菌培養皿中，蓋好培養皿蓋，將其置于鋁箔袋中，抽真空封口，即得到快檢產品。

1.2.3 測試片的使用方法

（1）樣本的處理。取檢測樣本25 mL（g）放入225 mL滅菌稀釋液（磷酸鹽緩沖液或生理鹽水）中，制成1∶10的樣品勻液，吸取1∶10的樣品勻液1 mL，注入含有9 mL稀釋液的試管內，搖勻后得到1∶100的樣品勻液，按上述方法依次稀釋。一般樣本選1～2個稀釋度進行檢測，含菌量少的液體樣本（如飲用水、礦泉水等）可直接吸取原液進行檢測。

（2）接菌。將測試片置于已滅菌的超凈工作臺上，打開上蓋，用滅菌槍頭吸取1 mL樣品勻液加到測試片上，使液體潤濕整張測試片，同時取1 mL稀釋液接種于另一測試片作空白對照，加蓋置于（28±1）℃培養箱中培養48～72 h。每個稀釋度接種3片。

（3）結果統計。霉菌在測試片上呈現灰色、黑色和藍綠色菌落，且菌落較大呈現其自身的形態；酵母菌再測試片上呈現綠色菌落，且菌落較小、表面平滑。

1.3 實驗內容

將培養好的酵母菌液用滅菌稀釋液稀釋至10-6、10-7兩個梯度，將霉菌稀釋至10-1、10-2備用。

1.3.1 濾紙處理方式對實驗結果的影響

設計兩個處理，濾紙片經0.05 mol/L Triton-Tris緩沖生理鹽水處理和不經處理，其他培養條件一致。吸取1 mL稀釋好的菌液接種于本測試片上，以1 mL滅菌生理鹽水作為空白對照，在（28±1）℃條件下培養48 h后進行結果統計。

1.3.2 本測試片與國家標準檢測法、3M試紙片法對比實驗

吸取1 mL稀釋好的菌液接種于本測試片、國家標準法推薦的平板及3 M測試片上，以1 mL滅菌生理鹽水作為空白對照，在（28±1）℃條件下培養48 h后進行結果統計。

1.3.3 不同培養時間下本測試片與國家標準檢測法對比實驗

設計兩個時間梯度，吸取1 mL稀釋好的菌液接種于本測試片及國家標準法推薦的平板上，以1 mL滅菌生理鹽水作為空白對照，在（28±1）℃條件下培養48 h和66 h后進行結果統計。

2 結果與分析

2.1 濾紙處理方式對實驗結果的影響

檢測霉菌的結果表明，經過處理的濾紙與國家標準的準確率達92%，濾紙未經處理的與國家標準的準確率為84%；檢測酵母菌的結果表明經過處理的準確率達103%，未經處理的為96%，說明經0.05 mol/L Triton-Tris緩沖生理鹽水處理后的濾紙檢測的結果更為準確。生理鹽水在微生物培養過程中，能夠保證細胞內外的滲透壓平衡，使微生物穩定存在，從而使實驗結果的準確性提高。

表1 濾紙處理方式對實驗結果的影響表

2.2 本測試片與國家標準檢測法、3M試紙片法對比實驗

將本實驗所得測試片與國家標準法和3M試紙片法進行對比實驗，發現本測試片檢測的結果與這兩種方法的準確度均達到97%以上，且相較而言本測試片的實驗結果差異小，結果穩定性好，見表2。

表2 本測試片與國家標準法、3M試紙片法的結果比較表

2.3 不同培養時間下本測試片與國家標準檢測法對比實驗

分別用本測試片和國家標準法培養樣本48 h和66 h，實驗結果表明，本測試片與國家標準的符合度均達到90%以上，其中培養霉菌的結果顯示培養時間為66 h的準確度低于培養48 h，而培養酵母菌的結果顯示培養時間為66 h準確度反而高于培養48 h的處理。說明本測試片的檢測結果可以達到國家標準。

表3 本測試片與國家標準法測試結果對比表

3 討論

本實驗得到一種可以同時用于檢測霉菌和酵母菌的快速檢測試紙片，利用微生物生化反應的特性，將微生物胞內酶的種類及反應條件作為微生物分類鑒定的主要依據，通過在培養基中加入特異性酶顯色底物，當目的菌在培養基上生長時，其特異性酶就能降解顯色底物，并產生帶有特殊顏色的代謝物，使菌落呈現特定的顏色或形態，從而實現樣本中霉菌和酵母菌的檢測。且本測試片操作簡便、培養48 h時判讀檢測結果準確率達到國家標準檢測方法97%以上，滿足實際檢測需求，具有很高的使用價值。