溶酶體和線粒體靶向的pH可激活熒光探針研究

王玉敏(云南師范大學，云南 昆明 650500)

0 引言

水合氫離子是生物系統中具有關鍵作用的物種。在生物體中細胞、體液、器官中的酸堿穩態與很多生物過程有關，如：細胞的增殖與凋亡、內吞作用、離子轉運等[1-2]。哺乳動物的細胞內pH 的范圍從4.5(溶酶體)到8.0(線粒體)。

1 溶酶體和線粒體pH 值對細胞生物過程的重要意義

溶酶體是細胞中的“消化車間”，含有多種水解酶，可以降解大多數生物分子[3-4]。在酸性環境中，pH 在4.5～5.5 的范圍內水解酶保持最佳的生物活性以進行消化和降解。對于癌細胞而言，細胞質和溶酶體中的pH 值均低于正常細胞[5]。溶酶體中pH 值的變化[6]可反映細胞狀態和代謝過程。線粒體是有氧呼吸和代謝的主要部位，是能源生產的主要細胞器[7]。此外，線粒體還參與了各種新陳代謝過程[8]，包括細胞分化，鈣離子穩態和細胞凋亡。細胞器中與pH 值變化有關的生物過程維持著生物體的正常功能，pH 值的輕微偏差會影響細胞的生理狀態，而pH 值的異常變化可能會神經退行性疾病甚至癌癥[9]等多種疾病。

2 亞細胞器靶向的pH可激活熒光探針的重要意義

近年來，隨著共聚焦激光顯微鏡分辨率的提高，pH 熒光探針已應用于細胞成像。細胞成像使人們能夠更加深入地了解亞細胞結構(如：溶酶體和線粒體)，為人們更好地了解與pH 有關的生理和病理過程提供了一種可能。近兩年來，已經開發出了溶酶體和線粒體靶向的pH 可激活的熒光探針。在這篇評論中，我們總結了已報道的兩種pH 熒光探針并探討了它們的結構設計、識別機理以及生物學應用。

3 溶酶體靶向的pH 可激活熒光探針

溶酶體是真核細胞具有的膜結合囊泡。在解離狀態下兩親性小分子能夠滲透溶酶體膜，但質子化后在酸性溶酶體中不滲透。

一般來說，在熒光探針分子中引入二甲基氨基，氰基和嗎啉的結構用于溶酶體定位。接下來，我們將討論最近剛剛報道的基于嗎啉基團的溶酶體靶向pH 可激活熒光探針。

課題組設計了探針1[10](如圖1 所示)，該探針以嗎啉為溶酶體靶向單元，羅丹明B 為熒光團，具有獨特的五元螺環，在中性和堿性pH 值下，螺環封閉，羅丹明B 幾乎不發熒光；在酸性條件下螺環打開時，會發出強烈的紅色熒光。此外，探針1 還有具有良好的光物理特性，極好的光穩定性以及低細胞毒性，因而探針1 適用于活細胞成像。pH 滴定研究表明探針1 在590 nm 處，出現熒光增強。在pH 范圍5.00～6.00 之間，pH 與熒光強度具有良好的線性關系，其pKa 值為5.42，適用于溶酶體pH成像。因此該探針在理解亞細胞器功能和溶酶體相關疾病的方面具有巨大的潛力。

圖1 熒光探針1的識別機理

4 線粒體靶向的pH 可激活熒光探針

線粒體具有磷脂雙層和蛋白質組成的外膜和內膜。根據能斯特方程，線粒體內膜上的電化學勢能累積親脂陽離子，在熒光探針的熒光團上引入親脂性陽離子，即可設計成線粒體靶向的熒光探針。一般來說，陽離子部分不參與檢測過程，僅用于線粒體定位。接下來，我們將討論最近剛剛報道的線粒體靶向pH可激活熒光探針。

近年來通過在半菁和羅丹明染料中引入閉合螺內酰胺環結構，設計合成的中性或弱堿熒光探針，使螺內酰胺開環的pKa 值低，可靶向溶酶體而不是線粒體。理想的具有線粒體靶向能力的熒光探針，應具有較高的pKa 值，基于此Tajiri 課題組通過將惡唑烷開關引入半菁染料設計合成了可以靶向監測活細胞內線粒體pH 變化的近紅外熒光探針2[11]。探針2 的半花青染料發生閉環反應，形成惡唑烷開關，游離羥基參與對吲哚部分的親核攻擊，導致熒光猝滅。在酸性條件下惡唑烷開關轉換為半花青素，π 共軛體系增大，并導致725 nm 處的熒光增強。當pH 從10.0 降低至5.0 時，吸光度在713 nm 處增加。探針2 還具有良好的光穩定性，對pH 的適度選擇性，低細胞毒性和熒光可逆性。此外探針2 還成功應用于HeLa 細胞線粒體pH的測定以及熒光成像分析。熒光探針2的識別機理如圖2所示。

圖2 熒光探針2的識別機理

5 亞細胞器靶向的pH 可激活的熒光探針小結

綜上所述溶酶體靶向的探針1 具有熒光開啟特征，以酰胺鍵為H+識別位點，在酸性條件下，五元螺環被打開，釋放出熒光團，嗎啉定位基可以特異性的定位在溶酶體中，可以高靈敏度地測量溶酶體的pH 值。線粒體靶向探針2 具有惡唑烷開關，在酸性條件下，惡唑烷開關轉換為帶正電荷的半花青染料，釋放出熒光團的同時定位在線粒體中，可以高靈敏度地測量線粒體的pH 值。

兩種亞細胞器靶向pH 可激活的熒光探針均具有可視化細胞內pH 分布和pH 變化的能力，能夠幫助人們了解復雜的生理和病理過程，具有廣闊的應用潛力。