一株生防芽孢桿菌的分離與鑒定

廣澤宇

（中國農業大學煙臺研究院，山東 煙臺 264003）

植物病害一直在農業生產中有較大影響，化學防治是控制植物病害的有效方法，其具有見效快、殺菌譜廣、成本低、使用簡便等優點［1］，但長期大量使用化學農藥致使病原菌產生了耐受性，并且農藥對人、畜和環境都有一定的危害。隨著近年來人們對食品安全及環境污染問題關注度的提高，一些化學殺菌劑在許多發達國家和地區已被嚴格限制使用［2］。生物防治技術是一種無殘留無污染、不殺傷天敵、不會產生抗藥性［3］、有利于人畜安全及環境保護的無公害環保技術，有利于提高經濟、社會、生態效益，有廣闊的發展前景［4］。因此，生物防治尤其是微生物防治在將來可能替代化學藥劑成為一個環保安全的選擇［5］。

本研究旨在從植物根際土壤中分離篩選對植物病原微生物具有生防作用的芽孢桿菌，對其進行鑒定。分離篩選出高效生防的芽孢桿菌，為以后拮抗型生物肥料以及生物農藥的生產提供高效的菌種，同時為菌種的工業化發酵生產提供科學的試驗數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物病原菌株。立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、葫蘆科刺盤孢Colletotrichumlagenarium、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、玉蜀黍離蠕孢（Bipolarismaydis）、鏈格孢（AlternariaNees）、尖孢鐮刀（Fusariumoxysporum）、腐皮殼霉（Fusariumsolani）、交鏈孢霉（Alternaria sp.），試驗室保藏。

1.1.2 主要試劑NA。固體培養基、NB液體培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）、FastDNA?SPINKitfor SoilDNA試劑盒，Trans2KPlusⅡ DNAMarker、6×DNA LoadingBuffer、Agarose、50×TBE。

1.1.3 儀器設備。生化培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）、霉菌培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（北京柏萊斯特科技發展有限公司）、核酸蛋白檢測儀（北京五洲東方科技發展有限公司）以及梯度PCR儀（上海拜力生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤中芽孢桿菌的分離與純化。從中國農業大學煙臺研究院校內菜地采集土樣，陰干研磨后稱取10g，放入100mL無菌水于250mL三角瓶中，搖動3～5min，在80℃水浴中加熱10min［6］。梯度稀釋涂布于營養瓊脂平板，28℃培養48h。挑取單菌落、鏡檢，根據單菌落大小、表面結構、質地、光澤和顏色等特征，挑取菌落形態差異明顯的單菌落，采用劃線分離的方法純化，將已純化的菌株保存于NA培養基斜面備用［7］。

1.2.2 拮抗菌株的篩選。對分離純化到的芽孢桿菌，以供試病原真菌為靶標，采用平板對峙培養法［8］，用皿內瓊膠平板直接測定。逐日觀察菌落的生長和細菌的抑制作用，選擇拮抗性好的菌株進入復篩。以初篩結論為基礎，在PDA平板中心先接種病原菌，一兩天后在四周接種同一種芽孢桿菌菌株，兩者相距5cm，3次重復，分別以細菌和病原菌在PDA上的純培養為對照，28℃培養，逐日觀察菌落的生長和細菌的抑制作用，篩選生長速度快、抑制率高的菌株。

1.2.3 生防芽孢桿菌優良菌株的初步鑒定

1.2.3.1 培養特征的觀察。參照《常見細菌系統鑒定手冊》［9］中的形態學指標，將菌株分別接種在牛肉膏蛋白胨培養基上，倒置于30℃的恒溫培養箱中培養48h，觀察生防菌株在培養基上的菌落的生長情況。

1.2.3.2 菌體形態的觀察。挑取在斜面培養48h的生防芽孢桿菌菌落于載玻片上，分別進行革蘭氏染色、芽孢染色、及莢膜染色，并在顯微鏡下觀察拮抗菌的大小和形態。

1.2.3.3 16SrRNA基因的擴增與測序。將菌種接種于LB液體培養基中，37℃溫度，200r/min過夜培養，12000r/min離心收集菌體，用FastDNATMSPINKitfor Soil試劑盒提取細菌基因組DNA。使用細菌16SrDNA通過引物27F和1492R對提取的基因組DNA進行PCR擴增［10］。PCR產物送英濰捷基（上海）貿易有限公司測序。

1.2.3.4 序列分析和系統發育樹構建。根據16sSrRNA測序結果，登陸NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列相似性比對搜索，從中獲得相似性較高的典型菌株序列作為參比對象，用MEGA8.0生物軟件進行多序列比對并構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 拮抗芽孢桿菌的分離篩選

本試驗共分離純化芽孢桿菌33株，經平板對峙試驗篩選出對病原菌具有拮抗作用的菌株6株，其中菌株B-Q4對立枯絲核菌、玉蜀黍離蠕孢、腐皮殼霉、交鏈孢霉均具有良好的拮抗作用，確定為最優菌株（如圖1所示）。

2.1.1 培養特征觀察結果。B-Q4在NA培養基平板上菌落為圓形或近圓形，直徑5mm，乳白色，質地軟、無色素、稍有光澤，表面有褶皺，蠟質，邊緣不整齊（如圖2所示）。

圖2 菌株在平板上的菌落特征

2.1.2 菌體形態觀察結果。B-Q4菌體呈短桿狀，在電子顯微鏡下大小為（1.0～1.2）μm×（3.0～4.0）μm，培養48h后產芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊無明顯膨大。革蘭氏陽性，無莢膜（如圖3所示）。

圖3 B-Q4菌體形態（電子顯微鏡下）

2.2 基因組DNA的提取及16SrDNAPCR擴增

利用FastDNATMSPINKitforSoil試劑盒提取的細菌基因組DNA，經過PCR擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（如圖4所示），獲得了約1500bp的條帶。

圖4 PCR產物電泳圖譜

注：M為Trans2KPlusⅡDNAMarker分子量標準1為B-Q416SrDNAPCR擴增產物。

2.3 16SrDNA序列分析比對結果

以B-Q4基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到的特異16SrDNA片段長度為1434bp（如圖5所示），將B-Q4菌株的16SrDNA測序結果在NCBI中進行Blast比對，結果表明，B-Q4菌株與BacilluscereusSP31的序列相似性達到99%，通過MEGA5.0軟件構建系統進化樹，結果顯示菌株B-Q4都與Bacilluscereus親緣關系最近。

圖5 特異16SrDNA片段長度

3 結論

本試驗對B-Q4菌株進行了分子鑒定及其生物學特性的研究。通過16SrDNA序列分析，對B-Q4進行分子鑒定，結果表明，B-Q4為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。B-Q4在NA培養基平板上菌落為圓形或近圓形，乳白色，質地軟、無色素、稍有光澤，表面有褶皺，蠟質，邊緣不整齊；在斜面上劃線培養呈直線生長；在液體培養基中生長，液體混濁具有菌膜。其形態學研究進一步說明B-Q4是蠟樣芽孢桿菌。

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