蔬菜幼苗葉面積快速測定方法篩選與優化

潘銅華 王云龍 楊俊偉 習林杰 丁娟娟 張 靜鄒志榮

（西北農林科技大學園藝學院，農業部西北設施園藝工程重點實驗室，陜西楊凌 712100）

葉片是植物進行光合作用及蒸騰作用的重要場所（曹儀植和宋占午，1998；喬寶營 等，2004；趙瀅 等，2012），葉面積大小是表征葉片光合能力、蒸騰能力、逆境脅迫程度、植株生長狀態以及預測植株生產力的重要指標（Steinger et al.，2003；田青 等，2008）。葉面積大小的精準快速測定，對于指導栽培管理、實現水肥管理優化、高產高效具有重要意義（陳卓 等，2010；盛雙 等，2011）。目前，測定葉面積的方法有很多種，如方格法、剪紙稱重法、公式回歸法、葉面積儀法、光電法、數值圖像處理法、打孔稱重法等（王穎 等，2016）。不同的方法各有利弊，需進行綜合評判（高建昌 等，2011；崔世鋼和秦建華，2017）。相比較而言，方格法具有工作量大、耗時長的缺點，但是結果較接近真實值，常用于對其他測定方法所得結果進行校正（柳覲 等，2014；李樂 等，2016）。剪紙稱重法測得結果受葉片形狀及人為因素的影響較大，同時受紙片均勻度影響（崔世鋼和秦建華，2017）。打孔稱重法操作比較簡單，省時省力，但是結果重復性較差，且誤差較大（王留梅 等，2001）。葉面積儀法操作簡單，但因其掃描方向與速度等受人為因素影響很大，難以實現勻速，誤差較大（孫嵐和馬德偉，1985）。光電法、數字圖像處理法等操作較簡單，但對操作技術要求較高，對于葉緣不規則的葉片難以捕捉其形狀；同時，測定結果受拍照角度、葉片大小、葉片形狀等多因素以及拍照技術、AutoCAD、Matlab、PS操作技術等的影響，且這些軟件操作對于較多葉片的測定比較費時（肖強 等，2005；田青 等，2008；張萬紅 等，2017）。隨著科技的不斷發展、儀器設備的不斷改進，采用高端儀器快速準確測定葉面積是今后的一種發展趨勢（劉關君 等，2004；孫雪文 等，2005）。

本試驗采用EPSON平臺掃描儀結合WinRHIZO根系分析系統測定番茄幼苗葉面積，比較其與常規葉面積測定法（方格法、打孔稱重法、葉面積儀法）測定結果的準確性、精確性與測定速度，并用不同材料進行驗證，最后對篩選出的最佳方法進行優化。旨在得到一種準確、精度高且快捷的蔬菜幼苗葉面積測定方法，為植物生理生態研究及栽培管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年3～4月在西北農林科技大學北校園藝場及人工氣候室內進行。供試材料為金棚1號番茄、早春2號黃瓜和碧螺6號辣椒，由楊凌裕豐農業科技有限公司提供。蔬菜幼苗種植于西北農林科技大學北校園藝場日光溫室中，在四葉一心時取樣進行不同方法葉面積測定與綜合評價。

1.2 主要儀器設備

愛普生掃描儀及WinRHIZO根系分析系統（EPSON Perfection V700 Photo，Canada regent，Canada）、AM200葉 面 積 測 定 儀（AM200，ADC BioScientific Ltd.，Hoddesdon，England）、HYZ-71計算紙（HYZ-712，上海頂峰繪圖紙廠）、千分之一天平（JD100-3，沈陽龍騰電子有限公司）。

1.3 試驗方法

分別剪取四葉一心的番茄、黃瓜及辣椒葉片若干片放在托盤中，蓋上濕潤的紗布，防止葉片萎蔫收縮。依次采取方格法、葉面積儀法、掃描分析法及打孔稱重法對隨機選取的4片番茄葉片進行葉面積測定，每個方法重復測定5次，計算平均值及標準誤。同時記錄5次測定的總時間，比較4種方法測定葉面積的用時長短。為盡量減少外界環境對試驗結果造成的影響，在測定過程中，通過空調、加濕器控制，使室內溫度控制在20℃左右，空氣濕度控制在60%～70%。

方格法：測定前用吸水紙吸干葉片表面水分，將葉片正面朝下平鋪于25 cm×35 cm大小的計算紙上，然后用三角板壓住一半，用鉛筆小心繪制另一半的邊緣輪廓，繪制完畢后，用手固定，并用三角板壓住，繪制另一半的邊緣輪廓。每兩次測定間隙用濕毛巾擦拭葉片保持葉片濕潤，繪制完立即用濕毛巾覆蓋，以防葉片萎蔫。所有葉片統一進行繪制。

葉面積儀法：采用ADC公司生產的AM200型便攜式平板葉面積儀，將葉片正面朝上，夾在平板葉面積儀的掃描區及透明壓板之間，通過調節掃描器左邊的黑色旋鈕，使測得葉片長度盡量接近葉片實際長度，按住“start”，勻速緩慢掃描葉片，當整個葉片掃描完畢，再按一次“start”停止掃描，得出葉面積。

掃描分析法：首先將葉片正面朝上平鋪于掃描區域，選擇掃描像素為200 dpi（高建昌 等，2011）；然后選擇“preview”預掃描葉片，用適宜大小的虛線框框住預掃描圖，選擇“scan”進行掃描，掃描結果以JEPG圖片格式保存。最后，插入根系分析儀電子狗，雙擊WinRHZIO軟件，打開掃描圖片，用虛線框框住圖片，單擊“OK”，得出測定結果，建立一個text文件保存結果。

打孔稱重法：采用直徑1 cm的打孔器獲得8個小圓片，稱取單個小圓片的質量，然后通過整片葉片的質量與單個小圓片的平均質量相比，換算出葉片的葉面積。

方法驗證與優化：采用方格法和掃描分析法對黃瓜葉片、辣椒葉片及已知面積的長方形紙片進行測定，試驗設5次重復，驗證掃描分析法測定結果的準確性。對掃描分析法的不同分辨率（50、96、150、200、300、400、600、800、1 200 dpi） 下 黃瓜葉面積的單次測定結果進行比較分析，并對準確性、精確性、所需時間等進行綜合比較，篩選最佳掃描分辨率。

1.4 數據處理

采用Excel 2007和DPS 7.05統計分析軟件進行數據處理、方差分析與顯著性檢驗（Duncan新復極差法），采用Excel 2007軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同測定方法的準確性與精確性比較

由圖1可知，與方格法相比，葉面積儀法測定的數據顯著偏低（平均降低12%～16%），而打孔稱重法測定值則顯著升高（平均升高4.2%～12.9%）。采用掃描分析法，除了2號葉的測定值顯著低于方格法以外，其余葉片測定值與方格法無顯著差異。通過分析測得的標準誤可知，打孔稱重法測得值與平均值之間偏離程度最大，葉面積儀法次之，而方格法與掃描分析法測定結果偏離平均值程度較小，說明掃描分析法和方格法的精度高，結果可重現性更好。同時，相比葉面積儀法和打孔稱重法，掃描分析法測定值更接近真實值，可以用于準確測定葉面積。

2.2 不同測定方法的用時比較

不同葉面積測定方法5次測定所需時間差異顯著（圖2）。方格法所需時間最長（5 205 s），葉面積儀法次之（690 s），而掃描分析法（498 s）和打孔稱重法（468 s）用時最少。綜合比較測定結果準確性（圖1）和所需時間（圖2），掃描分析法是一種快速、準確且精度高的幼苗葉面積測定方法。

2.3 葉面積測定方法驗證

2.3.1 黃瓜與辣椒葉片驗證 由圖3可知，采用掃描分析法，黃瓜和辣椒葉片葉面積測定值均顯著低于方格法，分別降低了2.59%和5.56%。掃描分析法的標準誤低于方格法，說明掃描分析法測得的數據精度更高，結果比較可靠。

圖1 不同葉面積測定方法對番茄葉片的測定結果比較

圖2 不同葉面積測定方法5次測定用時比較

圖3 蔬菜幼苗葉面積掃描分析法測定結果驗證

2.3.2 使用已知面積紙片驗證 用信封隨機剪取10個不同面積的長方形紙片，用直尺準確測定長和寬并計算面積，再用掃描分析法進行測定。由表1可知，掃描分析法測定結果與直尺測定值之間的誤差為-2.14%～3.02%，處于±5%之間，數據可靠，說明掃描分析法的測定結果接近真實值，可用于準確、快速測定葉面積。

2.4 掃描分析法中不同dpi設置的測定時間及測定結果比較

本試驗結果表明，掃描分析法可以快速、準確測定番茄、黃瓜及辣椒葉片的葉面積。以上結果是在掃描分辨率為200 dpi的條件下所得（高建昌 等，2011）。掃描分辨率是決定掃描儀獲得像素數量的重要因素，分辨率的高低可能對測定面積存在影響（李寶光 等，2006；高建昌 等，2011）。不同掃描分辨率條件下，掃描時間、掃描結果可能不同。由圖4-A可知，掃描分辨率越高，掃描及分析所需時間越長，其中dpi為50與96時所需時間最短，分別為40.9 s和44.5 s，二者無顯著差異，而96 dpi下測得的變異系數更大，50 dpi下的測定時間比較穩定。150 dpi與200 dpi的所需時間顯著高于前兩者。由圖4-B可知，不同掃描分辨率下測定結果無顯著差異。因此，掃描分析法中50 dpi的掃描分辨率即可快速、準確測定葉面積。

表1 基于不同面積紙片的掃描分析法測定結果驗證

圖 4 不同掃描分辨率下單次測定所需時間（A）及單個葉片測定結果（B）比較

3 討論

蔬菜幼苗葉面積大小是表征植株長勢強弱的一項重要指標（王穎 等，2016）。通常情況下，由于幼苗葉片較軟較薄，且葉面不平，準確快速測定葉面積難以實現。方格法作為一種經典的葉面積測定方法，測定結果比較接近真實值，常用于對其他測定方法的結果進行驗證（柳覲 等，2014；李樂 等，2016）。因此，本試驗選用方格法作為參考，比較幾種方法與方格法測定值間的差距。葉面積儀法（宋衛堂 等，2017；王京偉 等，2017）、打孔稱重法（朱艷 等，2017）是目前測定幼苗葉面積較為常用的方法。本試驗比較了葉面積儀法、掃描分析法和打孔稱重法測定葉面積的準確性與精確性，并比較了這些方法的操作簡便性，可為選擇適宜的葉面積測定方法提供參考。

本試驗發現，采用葉面積儀法測定的結果顯著低于方格法，可能是由于幼苗葉面積較小，導致操作平板葉面積儀時難以做到勻速，葉片難以完全掃描的緣故（孫嵐和馬德偉，1985）。而打孔稱重法測定的葉面積顯著高于方格法，可能是由于幼苗葉脈的密度顯著高于葉肉密度，且越靠近葉脈，葉片厚度增加，密度增大，使得小圓片的密度小于平均葉密度。本試驗還發現，葉面積儀法測定時間顯著高于掃描分析法，是因為葉面積儀法測定葉面積時受主觀因素影響更大，需要不斷調整明暗程度及手推速度以使測得葉長盡量接近實際葉長。本試驗以黃瓜和辣椒葉片為例，驗證掃描分析法的可靠度。結果發現，測得的辣椒葉片葉面積比方格法降低了5.56%，可能是由于辣椒葉片葉面積明顯小于黃瓜（前者葉面積約為后者的19.05%），導致同樣或較小的絕對誤差引起了更大的相對誤差。由于采用方格法測定葉面積也很難測得真實值，而紙片形狀規則、不易變形的特點更利于真實值的測定，因此，本試驗進行了基于不同面積紙片的掃描分析法結果驗證。測得結果與真實值間的誤差小于黃瓜或辣椒葉面積驗證過程的誤差，可能是由于方格法測定過程中下壓葉片的幅度遠大于掃描時幅度，導致方格法測得結果大于自然狀態下葉片葉面積，從而使黃瓜和辣椒驗證得到的誤差絕對值高于理論值，這也從另一方面說明了掃描分析法結果的準確性。

在結果可靠的基礎上，測定用時也是評價測定方法優劣的一個重要指標。本試驗發現，不同掃描分辨率下的測定結果無顯著性差異。隨著掃描分辨率的增加，所用時間逐漸增加，這可能是由于較大的掃描分辨率使掃描圖片所占磁盤空間更大，導致電腦運行速度減慢，與前人的研究結果一致（李寶光 等，2006），說明掃描分辨率設定越小越有利于快速準確測定葉面積。

目前，測定植株葉面積的方法有多種（王穎等，2016）。受試驗樣品（如葉片大小、葉片是否規則、是否野外操作等）（苑克俊和孫瑞紅 1994）、設備條件（設備價格、手持靈活性等）（宋英博 等，2015）、試驗目的（高精度測定或粗略估計、是否破壞性取樣）（肖強 等，2005）等的影響，所選用的葉面積測定方法不盡一致（柏軍華 等，2005）。因此需要根據試驗目的及試驗設備的易得性，選取合適的葉面積測定方法。通常，對于面積比較大的葉片以及只需快速粗略測定葉片面積時，建議采取打孔稱重法（烏蘭 等，2015）。對于設備比較簡陋或是缺乏高端設備（如葉面積儀、高端數碼儀器）、樣品面積較小且對結果要求比較精確時，可采取公式回歸法（王穎 等，2016）。對于葉面積很小且要求快速測定、對試驗結果要求不太精確時，可采用葉面積儀法（Qian et al.，2012；Zhang et al.，2015）。對于條件充足且對測定結果要求非常精確的科研工作者，可選用高端儀器設備（如數碼相機、掃描儀）與先進的數據分析軟件（如ImageJ、PS、CAD、Matlab、根系分析儀等）進行快速且精確的蔬菜葉面積測定（高建昌 等，2011；于守超 等，2012；趙瀅 等，2012；Shu et al.，2014；張萬紅 等，2017）。方格法作為一種最經典、最準確的葉面積測定方法，由于其操作的繁瑣性，通常只用于標定其他方法的準確性，而不建議用于實際的葉面積測定。

4 結論

不同葉面積測定方法所需時間、測得結果的準確性和精度均存在差異。相比方格法、葉面積儀法和打孔稱重法，掃描分析法兼具準確性高、精度高且用時短的優點。掃描分析法不同掃描分辨率下測定的葉面積無顯著差異，且選擇更低掃描分辨率測定所需時間更少，結果可靠。采用50 dpi掃描分辨率測定蔬菜幼苗葉面積，結果可靠、精度高、用時最少，可作為測定蔬菜幼苗葉面積的首選方法。