骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠牙槽骨結構及骨代謝生化指標的影響*

曾 輝 唐成芳 周 芳 左艷萍 張耀超

骨質疏松是中老年人的常見病和多發病，骨質疏松癥的主要特征包括骨礦密度降低、骨微結構破壞，以致骨的脆性增加，骨折危險性增高[1]。臨床及動物實驗研究證實,系統性骨質疏松患者同時伴有牙槽骨骨質疏松樣改變[2-3]。牙槽骨是上下頜骨包圍和支持牙根的骨組織，牙槽骨骨質疏松可加重牙周炎骨吸收[4]、延長種植體骨融合時間[5]，使牙齒及種植體松動、脫落、缺失率增加，妨礙老年人咀嚼、發音功能及面部協調美觀，嚴重影響老年人的身心健康和生活質量。因此，尋找防治骨質疏松的藥物，以維護老年人口腔及全身健康已成為一項重要任務。

骨碎補總黃酮是從中藥骨碎補中提取的有效成分。研究表明，骨碎補總黃酮可增加骨質疏松大鼠椎骨的骨量，改善骨三維結構[6]，并已初步運用于臨床骨質疏松癥的輔助治療[7]，但它對牙槽骨結構的影響及相關機制的研究尚未展開。本研究擬將骨碎補總黃酮以全身用藥的方式給予去卵巢雌性大鼠，觀察該藥對去卵巢大鼠牙槽骨結構的影響，同時觀察大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶水平以提供骨代謝信息，為骨碎補總黃酮防治牙槽骨骨質疏松的臨床應用提供實驗依據。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 24只3月齡雌性未孕SD大鼠(西安交通大學醫學院實驗動物中心提供)，體重230±30g。自由飲水，分籠飼養。適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為3組：對照組、模型組、骨碎補總黃酮組，每組8只。

1.1.2 實驗藥物與試劑 骨碎補總黃酮(中國中醫研究院西苑醫院和四川中藥研究所研制，批號961214)，使用時加滅菌水制成一定濃度溶液(0.46g·L-1)。水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙槽骨骨質疏松模型造模與給藥對照組僅切除雙側卵巢附近脂肪組織，其余兩組行雙側卵巢切除術，術后1周對建模大鼠進行陰道涂片，連續5d，觀察去卵巢大鼠不出現動情周期，表明去除卵巢成功。從去卵巢手術當天開始計時，術后3個月骨碎補總黃酮組給予骨碎補總黃酮216mg/(kg·d-1)灌胃治療，對照組和模型組給予等計量的生理鹽水，連續服藥12周。

1.2.2 血鈣(Ca)、血磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)濃度檢測 各組大鼠連續灌胃12周，腹腔注射麻醉后腹主動脈取血，3500r·min-1離心15min，取血清，采用日立7170型全自動生化分析儀檢測大鼠血清Ca、P、ALP濃度，血Ca、血P、ALP試劑盒(北京華英生物技術研究所，HY2468)。

1.2.3 牙槽骨病理形態觀察 連續灌胃給藥12周處死動物，取其左側下頜牙槽骨磨牙段，立即放入10%甲醛內固定48h后取出，10%EDTA脫鈣3周，常規石蠟包埋，沿下頜正中矢狀斷面切成5μm厚的連續切片，牙合染色，光鏡觀察。

1.2.4 牙槽骨骨組織形態計量學測量 上述各組大鼠下頜牙槽骨磨牙段常規制片，利用MOTIC微機圖像處理系統進行骨組織形態學測量。在光鏡下采集下頜第二磨牙兩個牙根之間松質骨圖像，依照等距隨機抽樣原則，同一標本選3張切片，每張切片選3個觀察視野。用Motic Med6.0數碼醫學圖像分析系統對上面所得圖像進行骨組織形態計量學相關參數測定，包括以下指標：總組織面積(T.Ar)、骨小梁周長(Tb.Pm)和骨小梁面積(Tb.Ar)。利用相關公式計算：骨小梁面積百分率%Tb.Ar=Tb.Ar/T.Ar×100%；骨小梁厚度Tb.Th=(2/1.99)×(Tb.Ar/Tb.Pm)；骨小梁間距 Tb.Sp=(T.Ar-Tb.Ar)/Tb.Pm[8]。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行分析。測量值以x±s表示，樣本間的比較采用單因素組間方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2.結果

2.1 牙槽骨組織病理形態觀察 光鏡下觀察大鼠下頜第二磨牙矢狀切面圖(圖1)可見：對照組大鼠下頜第二磨牙兩牙根間的牙槽骨由骨小梁和骨髓腔組成，骨小梁致密，整齊排列，相互連接，骨髓腔間隙小，未見異常骨吸收；模型組大鼠牙槽骨吸收嚴重，骨小梁稀疏、斷裂、排列紊亂，局部呈蠶食樣改變，骨髓腔增大，出現骨質疏松樣改變；經骨碎補總黃酮治療后，可見牙槽骨骨小梁變粗呈片狀，骨髓腔縮小，骨小梁間隙減小，骨量增多。

圖1 各組大鼠牙槽骨病理組織學改變(HE 100×)

2.2 牙槽骨形態計量學參數測量 由表1可知，與對照組相比，模型組%Tb.Ar減少36.72%(P＜0.05)，Tb.Th 顯著減小(P＜0.05)，Tb.Sp 顯著增加(P＜0.05)。與模型組相比，骨碎補總黃酮組%Tb.Ar升高39.91%(P＜0.05)，Tb.Th顯著增高(P＜ 0.05)，Tb.Sp 顯著減小(P＜ 0.05)，其中%Tb.Ar已與對照組無統計學差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠牙槽骨骨小梁參數(s,n=8)

表1 各組大鼠牙槽骨骨小梁參數(s,n=8)

注：*與對照組比較P＜0.05；#與模型組比較P＜0.05。

組別 骨小梁面積百分率%Tb.Ar骨小梁厚度Tb.Th(μm)骨小梁間距Tb.Sp(μm)對照組模型組骨碎補總黃酮組51.63±11.96#32.67±3.06*45.71±9.25#156.98±42.14#107.54±25.08*139.08±50.13*#128.78±33.21#256.39±50.68*166.37±33.61*#

2.3 各組大鼠血Ca、P、ALP濃度變化 如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠血Ca顯著降低(P＜0.05)，ALP顯著升高(P＜0.05)。骨碎補總黃酮治療后，可顯著升高大鼠血Ca(P＜0.05)，降低ALP水平(P＜0.05)，但對大鼠血P無明顯作用。

表2 各組大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶濃度(x±s,n=8)

3.討論

近年來，不少學者對全身性骨質疏松與牙槽骨骨質疏松間的關系做了若干研究，大多研究結果證實牙槽骨骨量丟失、出現骨質疏松樣改變是全身骨質變化的局部表現[9]。本實驗中，模型組大鼠牙槽骨骨小梁稀疏，出現大的骨髓腔，呈典型骨質疏松樣改變。骨碎補總黃酮是骨碎補中所含黃酮類化合物的總和，具有補腎壯骨、續傷止痛的功效。體外實驗證實，骨碎補總黃酮能促進人牙周膜細胞增殖[10]，而牙周膜中成功分離的干細胞正是牙槽骨再生的主要細胞來源；動物實驗研究顯示，骨碎補總黃酮能改善骨質疏松大鼠股骨微結構，增加骨密度和機械強度[11]；臨床研究證實骨碎補總黃酮能有效治療絕經后女性骨質疏松癥,可有效緩解骨質疏松性骨痛癥[12]。由于口腔骨丟失是全身骨質變化的局部表現，因此，應用骨碎補總黃酮對牙槽骨骨質疏松進行防治研究具有合理性。

本研究顯示，骨碎補總黃酮連續治療12周后，牙槽骨組織形態較模型組顯著改善，骨髓腔減小、骨小梁變粗。骨組織形態計量學結果顯示：經骨碎補總黃酮治療后牙槽骨骨小梁厚度、骨小梁面積百分率較模型組顯著增加(P＜0.05)，骨小梁間距顯著減小(P＜0.05)，其中骨小梁面積百分率與對照組相比已無統計學差異(P＞0.05)。以上結果說明，骨碎補總黃酮對卵巢切除所致的牙槽骨結構的破壞有明顯改善作用,對牙槽骨骨質疏松癥有明顯的防治作用。

血清鈣磷濃度變化在骨礦代謝中占有重要位置，其中血清中鈣含量的檢測對鈣磷代謝的研究具有重要意義[13]。本研究中，骨碎補總黃酮可顯著增加去卵巢大鼠血鈣濃度(P＜0.05)，提示其可抑制血清中鈣含量的丟失，從而影響骨礦代謝。各組之間血磷濃度差異無統計學意義(P＞0.05)，這與楊鋒等[14]研究結果一致，而血磷水平穩定正是骨生長和礦化的必要條件之一[15]。血ALP是反應骨代謝最重要的酶，是最常見的評價骨形成和骨轉換的指標[16]。本實驗中，模型組大鼠血清ALP升高可能是骨質流失、骨吸收亢進伴成骨細胞功能活躍的結果，反映了骨改建的活躍狀態，骨碎補總黃酮連續治療12周后可顯著降低大鼠血ALP水平，說明骨碎補總黃酮能糾正去卵巢所致大鼠血ALP水平升高的高骨轉換率現象。本實驗中骨碎補總黃酮治療組仍有一些檢測指標未恢復至正常水平，可在后期進一步研究其最佳給藥劑量及治療時間。

綜上所述，去卵巢可誘導大鼠牙槽骨骨量丟失，出現骨質疏松樣改變，血清骨代謝指標表現為骨高轉換。骨碎補總黃酮可以明顯改善牙槽骨結構、增加牙槽骨骨量，血清骨代謝指標提示其可能通過降低骨高轉換，抑制牙槽骨吸收，促進牙槽骨形成。但其具體影響機制、最佳劑量及給藥時間等還需要進一步研究和探討。