不同培養基對蝴蝶蘭雜交種子無菌播種生長的影響

陳春滿，張善信，范俊強，羅耿周

（東莞市生物技術研究所，廣東 東莞 523086）

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）是著名的蘭花品種，原產于亞洲熱帶地區，從喜馬拉亞山到澳洲北部均有分布。其花型、花色豐富多彩，花朵數多，開花期長，深受國內外消費者喜愛，被譽為“蘭花皇后”。蝴蝶蘭可通過人工調控花期于春節前開放，極大滿足了國內年宵花的市場需求。隨著種植面積和產銷量的急速增加，我國蝴蝶蘭產業得到跨越式發展，大陸已逐漸成為全球蝴蝶蘭種苗供應中心。

蝴蝶蘭種質資源豐富，通過人工雜交可培育出新品種。我國臺灣地區的蝴蝶蘭育種走在世界前列，我國大陸于20世紀90年代也開始進行蝴蝶蘭新品種選育工作，已陸續不斷有新品種問市［1-5］。在新品種培育過程中，播種是很關鍵的一步，不同的品種雜交、不同的試驗方法均會影響到小苗的出苗率。余慧琳等［6］、田甜［7］認為基本培養基影響蝴蝶蘭雜交種子的萌發，徐曉薇等［8-10］認為椰子水有利于蝴蝶蘭種子的萌發。為此我們設計了不同的方案進行播種試驗，以探索出蝴蝶蘭不同雜交種子萌發、分化、壯苗及生根的最有利因子，為蝴蝶蘭雜交育種的長足發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雜交用的大花型母本植株大辣椒和紅太陽從廣州花之美園藝公司引進，小花型母本植株小深紅、白唇、小白兔和紅鉆從福建漳州鉅寶生物科技有限公司引進。參試的8個雜交組合分別為：1號：大辣椒（♀）× 白唇（♂）；2號：白唇（♀）×大辣椒（♂）；3號：紅鉆自交；4號：小白兔（♀）×大辣椒（♂）；5號：大辣椒自交；6號：紅鉆（♀）×大辣椒（♂）；7號：大辣椒（♀）×紅太陽（♂）；8號：小深紅（♀）×大辣椒（♂）。其中，1～3號授粉后4個月采摘其雜交果莢進行播種，用于觀察種子萌發；2號和4～6號的種芽用于觀察基本培養基對芽分化生長的影響；1～8號用于觀察有機附加物對芽分化生長的影響，種芽為種子萌發后40～50 d、直徑大小0.2～0.3 cm的胚性芽；1號和3～4號雜交種子生長形成的小苗用于觀察其在壯苗和生根階段的生長情況，每株小苗具有兩片0.5～1.0 cm的小葉，無根。

1.2 試驗方法

1.2.1 果莢處理 授粉后4個月的成熟蝴蝶蘭雜交果莢經自來水沖選干凈，用75%酒精表面消毒1 min，滅菌水沖洗1次，在無菌超凈臺上用0.1%升汞滅菌8 min，再用滅菌水沖洗3次后取出。在無菌碟上，用解剖刀縱向切開果莢，將粉狀種子輕輕夾出，撒播在無菌的誘導萌發培養基上，每個果莢的粉狀種子可均勻撒播在5～6瓶培養基上。

1.2.2 不同培養基對蝴蝶蘭雜交種子萌發的影響 測定種子萌發的培養基共6個：處理1：MS+椰子水100 mL/L、處理2：1/2MS+椰子水100 mL/L、處理3：1/3MS+椰子水100 mL/L、處理4：1/4MS+椰子水100 mL/L、處理5：1/2MS+馬鈴薯汁100 g/L、處理6：1/2MS+蘋果汁10 g/L。每個處理均添加2.5%白糖、瓊脂6 g/L，pH調節至5.6～5.8，下同。試驗在恒溫恒光條件下進行，培養溫度25～28℃，光照強度2 000～2 500 lx、光照時間12 h/d。1～3號蝴蝶蘭雜交種子均分為6份，每個處理接種1份，每份接種1瓶，5次重復，播種后40 d統計不同處理每瓶種子萌發數量，取平均值。

1.2.3 不同基本培養基對蝴蝶蘭雜交種子芽分化生長的影響 以萌發后的胚性芽為試材，以MS、1/2MS、1/3MS為基本培養基，分別添加馬鈴薯汁150 g/L，觀察3個基本培養基對2號、4號、5號、6號4個雜交種子芽分化生長的影響。每個處理接種10瓶，40 d后觀察記錄鮮重增加值。

1.2.4 添加不同有機附加物對蝴蝶蘭雜交種子芽分化生長的影響 以1/2MS為基本培養基，分別添加馬鈴薯汁0～150 g/L、椰子水0～100 mL/L、香蕉汁0～100 g/L，共9個處理（T1：1/2MS+馬鈴薯汁50 g/L、T2：1/2MS+馬鈴薯汁100 g/L、T3：1/2MS+馬鈴薯汁150 g/L、T4：1/2MS+椰子水100 mL/L、T5：1/2MS+椰子水100 mL/L+馬鈴薯汁100 g/L、T6：1/2MS+椰子水100 mL/L+馬鈴薯汁50 g/L、T7：1/2MS+香蕉汁50 g/L+馬鈴薯汁50 g/L、T8：1/2MS+香蕉汁100 g/L+馬鈴薯汁50 g/L、T9：1/2MS+香蕉汁100 g/L），每個處理10瓶，觀察不同有機附加物對8個雜交種子芽分化生長的影響，40 d后記錄每瓶鮮重增加值。

1.2.5 不同培養基對蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長的影響 以1/2MS為基本培養基，分別添加馬鈴薯汁150 g/L、椰子水0～100 mL/L、香蕉汁0～100 g/L、白糖2.5%～3.0%，共6個處理（C1：1/2MS+馬鈴薯汁150 g/L+白糖2.5%、C2：1/2MS+馬鈴薯汁150 g/L+白糖3%、C3：1/2MS+香蕉汁25 g/L+馬鈴薯汁150 g/L+白糖2.5%、C4：1/2MS+香蕉汁50 g/L+馬鈴薯汁150 g/L+白糖2.5%、C5：1/2MS+香蕉汁100 g/L+馬鈴薯汁150 g/L+白糖2.5%、C6：1/2MS+馬鈴薯汁150 g/L+椰子水100 mL/L+白糖2.5%），觀察其對1號、3號、4號3個雜交種子組培苗壯苗和生根生長的影響。每個處理接種10瓶，每瓶接種25株苗，培養前后稱重，60 d后記錄不同處理根、莖、葉鮮重，統計不同處理培養后莖葉、根及總鮮重的平均增長量。

1.3 數據統計方法

采用Excel整理數據，采用SPSS軟件進行方差分析，LSD法進行多重比較和差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對蝴蝶蘭雜交種子萌發的影響

由圖1可知，在以1/3 MS為基本培養基的處理3中，3個不同蝴蝶蘭雜交組合種子萌發率高于以1/4 MS為基本培養基的處理4及以MS和1/2MS作基本培養基的處理1和處理2。處理3中的3個雜交種子均表現為萌發率較高、顆粒較大，散落在瓶子周圍的顆粒均能發芽，處理4的萌發情況稍差于處理3，處理1最差，表現為不萌芽或種子萌發但死亡較多。表明一定的低鹽濃度有利于蝴蝶蘭種子萌發，過高或過低的鹽濃度均不利于種子萌發。以1/2MS為基本培養基添加馬鈴薯汁100 g/L的處理6種子萌發率高、顆粒大、長勢旺，表現最好；添加椰子水100 mL/L的處理次之，添加蘋果汁10 g/L的處理最差，表現為萌芽率低、萌發后死亡現象多、無活力，表明不同有機附加物對蝴蝶蘭種子萌發有較大影響（圖2～圖4，封二）。

圖1 3個蝴蝶蘭雜交種子在6種培養基的萌發比較

2.2 不同基本培養基對蝴蝶蘭雜交種子芽分化生長的影響

不同基本培養基對蝴蝶蘭雜交種子芽生長的影響如表1所示。以1/2MS為基本培養基的雜交種子芽表現為鮮重較重，除7號外，其他種子芽在1/2MS培養基中的鮮重均大于MS或1/3MS，表現為長葉長根較快、葉子大、芽多、長勢好（圖5，封二）。表明多數蝴蝶蘭雜交種子在相同培養基處理中的表現類似，即過高鹽濃度（MS）對蝴蝶蘭雜交種子芽的分化和生長不利，過低鹽濃度（1/3MS）養分不足，植株生長也不好。以1/2MS為基本培養基的處理其植株鮮重和長勢均較好。不同雜交種子芽的分化速度不同，以6號分化效果較好，表現為鮮重較重；而7號種子芽的分化和生長能力較低，鮮重較輕。

表1 不同基本培養基對蝴蝶蘭雜交種子芽鮮重（g）影響

2.3 添加不同有機附加物對蝴蝶蘭雜交種子芽分化生長的影響

8個雜交種子胚性芽在添加不同有機附加物培養基中的表現如表2所示。從表2可以看出，以添加馬鈴薯汁150 g/L的T3處理的芽分化生長效果最好、平均芽鮮重為26.60 g，其次是T5、平均鮮重為19.32 g。只添加馬鈴薯汁50 g/L（T1）和香蕉汁100 g/L（T9）處理的芽生長較差，鮮重分別只有12.08、14.76 g。表明添加一定量的馬鈴薯汁有利于蝴蝶蘭芽分化期的生長，表現為鮮重增加明顯、葉片分化快、根莖葉較重。在相同培養基處理中，不同蝴蝶蘭雜交種子芽生長情況不一致。8號雜交種子芽生長勢最好，表現為平均鮮重最重、為29.97 g，其次是3號和6號，鮮重分別為23.86、21.34 g，而7號種子萌發后鮮重生長勢最差，平均鮮重只有3.4 g，表明不同雜交種子芽在離體環境中適應程度不同。

表2 添加不同有機附加物對蝴蝶蘭雜交種子芽鮮重（g）的影響

2.4 不同培養基對蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長的影響

圖6 不同培養基對1號蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長的影響

圖7 不同培養基對3號蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長的影響

圖8 不同培養基對4號蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長的影響

從圖6～圖8可以看出，3個蝴蝶蘭雜交種子在C5培養基中的組培苗總鮮重、根重和莖葉重的平均增長量顯著優于其他處理，表現為葉子挺立、葉大而多、根系、長勢好。表明不同雜交種在組培苗的壯苗和生根階段對培養基的要求較為一致。但是不同雜交種的組培苗生長速度和整齊度不一致，3號種子組培苗生長勢較好，在不同處理中均表現為長勢好、整齊（圖9，封二）。而1號種子苗在不同處理中的葉子長勢均不佳。添加椰子水100 mL/L的C6培養基中組培苗表現為根少、葉片小，可見椰子水不利于組培苗的壯苗和生根。添加白糖濃度為3%的培養基中，除3號種子根系鮮重顯著增加外，大部分組培苗的葉片鮮重和總鮮重增長沒有顯著增加，表明白糖適當減少對多數品種生長有利。

3 結論與討論

本研究結果表明，不同蝴蝶蘭雜交種子離體培養過程中，在種子萌發、芽分化和壯苗生根階段，其生長表現不同，有些雜交種呈現萌發率高、芽分化和生長速度快、苗較壯實，而有些雜交種表現為適應性較差，萌發率較低、生長分化較為緩慢，這與魏翠華等［16］報道一致，可能與不同雜交種的基因型不同有關。

基本培養基對不同蝴蝶蘭雜交種子的組培苗生長有較相似作用。在種子萌發階段，以1/3MS為基本培養基的雜交種子萌發效果均較好，表現為萌發率高、顆粒大、長勢好［11-16］。本試驗結果表明，1/2MS優于MS和1/4MS，但1/3MS在不同的雜交組合中種子萌發情況更優于1/2MS，是對前人工作的一種補充。在芽的分化和壯苗階段以1/2MS作為基本培養基，苗的生長效果較好，表現為鮮重較重、葉子分化較快、苗壯，表明種子在不同生長階段需要不同的鹽濃度比例。在萌發階段需要更低的鹽濃度，過高或過低的無機鹽濃度均不利于種子萌發。在芽的分化和壯苗階段，培養基中的鹽濃度需要比種子萌發階段提高一些，這可能是因為種子發育后期需要稍高濃度的營養元素。

有機附加物對不同雜交種子組培苗生長有較相似作用［18-21］。本試驗結果表明，不同蝴蝶蘭雜交種子在萌發和生長階段，添加馬鈴薯汁比椰子水有更明顯的促進作用。這與余慧琳等［6-9］的報道有所差異，他們認為椰子水更有利于蝴蝶蘭種子的萌發，需要更進一步的驗證。在芽分化階段，馬鈴薯汁較高濃度（150 g/L）優于較低濃度（50 g/L）；在壯苗和生根階段，較高濃度的馬鈴薯汁和香蕉汁具有明顯的促進作用，表現為根莖葉生長明顯，表明馬鈴薯汁在蝴蝶蘭種子播種和組培生長過程中有重要作用，與杜云安［17］研究結論相符。這可能與馬鈴薯汁富含蛋白質、硫胺素、維生素C、維生素E、維生素A、磷、鉀等［22］有關。添加香蕉汁利于組培苗后期生長，用量大作用更明顯，也與杜云安［17］報道一致。

本試驗中，蝴蝶蘭種子從萌發到生根壯苗，均不需要加入外源激素，種子自身的激素已足以使其快速萌發和增殖。從生產角度考慮，如果要快速增加庫存量，可以增加一定量的外源激素，如果作為雜交種后代的選育，我們認為不需要加入外源激素也可正常獲得較大量的后代數量。