蛹蟲草固態發酵杜仲的工藝優化

徐麗麗，梁建東，柴宇航，陳萬浩，田維毅，韓燕峰，梁宗琦，王 平

（1.貴陽中醫學院基礎醫學院，貴州 貴陽 550002；2.貴州大學真菌資源研究所，貴州 貴陽 550025）

生物轉化是利用微生物、動植物培養體系（包括真菌、細菌、植物離體細胞、組織或器官及動物細胞等）或其產生的酶系對外源性化合物進行修飾以獲得新的衍生物的反應過程［1］。在此過程中，真菌因具有分解纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等營養物質的胞內或胞外酶系，較強的分解利用能力，及種類繁多、次生代謝產物多等優點，因而成為主要的功能菌［2］。隨著人們對健康需求的增加和形勢發展，許多藥材的傳統應用方式已無法滿足市場對這類中藥資源的開發需求和多樣化應用。提高藥材的應用范圍和層次，本著減毒、增效、拓展應用的目的，結合真菌與中藥的生物轉化技術應運而生，并逐步深入我國傳統中藥的研發中，如應用蛹蟲草〔Cordyceps militaris （L.） Link〕固態發酵西洋參、人參根須等，發現其發酵前后人參皂苷的種類及含量均有較大差異，表明蛹蟲草菌株所產生的酶系對傳統中藥具轉化作用［3-4］。

杜仲（Eucommia ulmoides oliv）為冰川運動殘留下來的杜仲科植物，主要以樹皮入藥，是貴州主要的道地藥材之一。《中國藥典》規定其樹皮和葉均可入藥，具備補肝腎、強筋骨、安胎等功效，用于肝虛腎弱、腰酸膝痛、痿軟無力、胎動不安、妊娠漏血［5］。現代研究表明，杜仲的主要特征性成分為松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside，PDG），具雙向調節血壓這一特有功能［6］。

通過前期蛹蟲草固體發酵杜仲的單因素實驗，選出最優單因素條件為：添料（杜仲粉）量10%、維生素E（Vitamin E，VE）4 g/kg，葡萄糖4 g/kg，硫酸銨4 g/kg，初始pH 8，接種量40%，最適溫度25℃，培養時間15 d，并且發現在考察添料（杜仲粉）量、碳源、氮源、初始pH時，PDG和蟲草素的含量同時降低，對于生長因子和接種量則表現為同時升高，而培養溫度和培養時間是一升一降。本研究在這些前期實驗基礎上對蛹蟲草固體發酵杜仲的培養基組成及發酵條件進一步優化，以期最大限度地提高發酵產物中有效成分PDG和蟲草素的含量，為固體發酵產物的規模化生產提供參考，也將為發酵產物在藥品和保健品等領域的應用發揮促進作用，服務于大健康產業。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛹蟲草菌株C. militaris B1 528于2 015年2月分離自貴陽花溪農貿市場購買的蛹蟲草人工子實體，使用甘油凍存管，-80℃保存于貴陽中醫學院基礎醫學院真菌室。

平板培養基：常規PDA培養基。

液體種子培養基：土豆（20%），葡萄糖（2%），水（1 000 mL），pH值自然。

初始固體發酵培養基：杜仲粉（30%），大米（70%，自來水浸泡過夜），土豆汁（含20%土豆，0.2%），pH值自然，121℃滅菌45 min。

最終優選的固體發酵培養基：杜仲粉（27%），大米（73%，pH 8的自來水浸泡過夜），VE 4 g/kg、葡萄糖4 g/kg，硫酸銨8 g/kg，土豆汁（含20%土豆，0.2%，pH 8），121℃滅菌45 min。

主要儀器與試劑：HCB-1300V型垂直層流潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司），HZQ-QB培養搖床、SPX-150A生化培養箱（蘇州威爾實驗用品有限公司），安捷倫高效液相色譜儀1260，200T高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司），PL303型精密電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），港威超聲（江蘇省張家港市港威超聲電子有限公司）。松脂醇二葡萄糖苷對照品（北京世記奧科生物技術有限公司，批號為63902-38-5C32H42016），蟲草素對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號為110858-201503），乙腈（色譜純，美國天地），甲醇（色譜純，天津科密歐化學試劑公司），氯仿（分析純，西隴科學股份有限公司），娃哈哈純凈水，杜仲購于貴陽藥材市場（經貴陽中醫學院李瑋教授鑒定為杜仲的干燥樹皮）。

1.2 試驗設計

1.2.1 平板培養 將蛹蟲草B1 528轉接于PDA培養基上，25℃黑暗條件下培養7 d。

1.2.2 種子培養 無菌條件下，用打孔器從平板中打取直徑為5 mm的活化菌種并接入液體種子培養基中，于25℃、200 r/min黑暗條件下震蕩培養5 d。

1.2.3 固體發酵培養 將40%液體菌種移接于初始固體培養基中，攪拌均勻，并于25℃恒溫培養箱中培養15 d（優化后培養基培養18 d）。

1.3 檢測方法

精密稱取發酵產物4.0 g，加入40 mL氯仿液，超聲30 min，棄去氯仿殘液，揮干藥渣，再加入40 mL甲醇，超聲45 min，提取液過濾并濃縮至10 mL以下，移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續濾液，即得發酵產物提取液［7］，采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定。

色譜條件：色譜柱Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫20℃，檢測波長277 nm，流速1.0 mL/min，進樣體積10 μL，流動相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫條件：0～10 min，95%～85.5%A；10～23 min，85.5%～85.4%A；23～33 min，85.4%～95%A。

1.4 Plackett-Burman實驗

根據前期單因素實驗結果，運用Design-Expert.V8.0.6軟件的Plackett-Burman，選取實驗次數N=12的實驗設計，對發酵培養基組成及培養條件共8個因素進行考察，每個因素分別取高、低兩個水平，同時另設3個虛擬變量以考察實驗誤差，發酵產物經HPLC法檢測蟲草素和PDG含量，作為PB實驗的響應值，篩選顯著因子。

1.5 最陡爬坡實驗

響應面擬合方程只有臨近考察領域內才能充分體現真實情況，因此采用最陡爬坡法逼近最佳值區域，建立有效的響應面擬合方程。以PB實驗結果為依據，以實驗值變化的方向為爬坡方向，結合各因素效應值大小的比例設定其變化步長，以坡度最高點作為后續實驗的零點。

1.6 Box-Benhnken實驗

根據最陡爬坡實驗找到的中心點，利用Design-Expert響應面分析中的Box-Benhnken實驗法進行三因素三水平的實驗，取實驗次數N=15，其中零點實驗重復3次，以估計實驗誤差，進而得到優化條件及相應的理論值。

1.7 驗證試驗

對優化后的發酵條件進行平行驗證實驗，以檢驗實驗數據與理論預測值是否相符，從而得到優化配方。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗設計及顯著因子確定

采用N=12的Plackett-Burman設計，對接種量（X1）、添料（杜仲粉）量（X2）、培養溫度（X3）、培養時間（X4）、硫酸銨（X5）、初始pH（X6）、VE（X7）、葡萄糖（X8）8個因素進行考察，每個因素分別取高低兩個水平，響應值為蟲草素和PDG，實驗設計及結果見表1。

方差分析結果（表2）表明，添料（杜仲粉）量、培養時間、硫酸銨這3個因素對應蟲草素置信區間95%以上，PDG置信區間在95%以上的有接種量、添料（杜仲粉）量、培養溫度、培養時間、硫酸銨5個因素。其中添料（杜仲粉）量、培養時間、硫酸銨等因素顯著性最明顯，是影響蛹蟲草轉化杜仲固體培養的重要因素，因此，把其他因素控制在較好水平上，選擇添料（杜仲粉）量、培養時間、硫酸銨3個因素做進一步響應面實驗。

2.2 爬坡實驗

最陡爬坡法是以Plackett-Burman實驗結果為基礎，主要因素添料（杜仲粉）量（X2）、培養時間（X4）、硫酸銨（X5）均為正效應，爬坡方向應增加，根據其效應值大小的比例分別設定其爬坡步長，蟲草素、PDG及綜合評分為響應值。綜合評分是以各成分的最大值為參照將數據進行歸一化，再給出不同的權重，各成分權重系數均設為0.5，Y=（各樣品中蟲草素含量÷樣品中蟲草素最高含量）×0.5×100 +（各樣品中PDG含量÷樣品中PDG最高含量）×0.5×100［8］。由于杜仲濃度過高時菌種生長較弱或未見生長，因此采用添料（杜仲粉）量2%為其爬坡步長。實驗設計及結果（表3）表明，實驗3添料（杜仲粉）量（X2）20%、培養時間（X4）18 d、硫酸銨（X5）8.0 g/kg的綜合評分達92.50分，為最優實驗條件，因此是后續實驗的中心點。

表1 Plackett-Burman實驗設計與結果

表2 方差分析結果

2.3 Box-Benhnken實驗及響應面分析

在爬坡實驗結果的基礎上，以添料（杜仲粉）量（X2）20%、培養時間（X4）18 d、硫酸銨（X5）8.0 g/kg為中心點，根據Box-Benhnken實驗設計進行，實驗設計及結果見表4、表5。

表3 最陡爬坡實驗設計和結果

表4 Box-Behnken實驗因素與水平

表5 Box-Behnken實驗設計及結果

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行二次回歸擬合，可得到擬合方程：

從方差分析結果（表6）可知，蟲草素、PDG模型項P值<0.05，說明方程擬合很好；蟲草素、PDG失擬項P值>0.05，說明該方程殘差由隨機誤差引起。模型決定系數分別為R2=0.9920、0.9337，說明相關性良好，模型與實際情況擬合很好。

根據表5的實驗結果作三維響應面圖（圖1、圖2、圖3），并對模型進行求導，對求導結果四舍五入取整數得添料（杜仲粉）量（X2）=27、培養時間（X4）=18、硫酸銨（X5）=8，結合前期單因素實驗結果，得最優培養條件和培養基組成為：VE 4 g/kg，葡萄糖4 g/kg，硫酸銨8 g/kg，初始pH8，添料（杜仲粉）量27%，接種量40%，培養溫度25℃，培養時間18 d，在此條件下蟲草素和PDG的預測產量分別為2.93、89.00 μg/g。

表6 回歸模型方差分析結果

圖1 培養時間、添料（杜仲粉）量與PDG產量的響應面圖

圖3 硫酸銨、培養時間與PDG產量的響應面圖

2.4 實驗結果驗證

為驗證預測值的準確性，按響應面實驗分析出的最優培養基組合和培養條件進行發酵，并與初始培養基作對比。結果蟲草素和PDG的產量分別為 2.92±0.07、90.03±1.07 μg/g，與預測值非常接近，且較優化前蟲草素和PDG產量（1.82±0.03、58.88±0.84 μg/g）分別提高60.44%、52.90%。

表7 驗證實驗結果

3 結論與討論

采用真菌固體發酵能顯著提高中藥材中有效成分的含量，如土生曲霉以三七為基質原料進行固態轉化，三七中原人參二醇型皂苷Rd及原人參三醇型皂苷Rg1含量得到大幅度提高［9］；冬蟲夏草蝙蝠蛾擬青霉固態發酵人參藥材可同時獲得人參稀有皂苷Rd、腺苷、蟲草素、甘露醇等活性物質，實現一次發酵雙向轉化，同時獲取兩種藥物的有效成分，起到協同增效的作用［10］；靈芝發酵人參殘渣可顯著提升人參皂苷Rd的含量［11］；功能真菌M1固體發酵人參，能夠大幅度提高人參藥材中總皂苷的含量，其增長率最高可達103.82%［12］。逄世峰等［3］、閆梅霞等［4］的研究也表明，蛹蟲草作為一種食藥用真菌，在中藥的生物轉化中是一種可利用的有效資源，與本試驗結果一致。

發酵培養基組成、培養條件及原材料質量對代謝產物的種類及產量均有較大影響，通過改變培養基組份、培養條件，選取高質量的藥材和優質菌種可顯著提高其有效成分的產量及成分配比。本研究選取未經任何處理的生杜仲作為試驗材料，以確保藥材的質量。在實際生產中，大米作為天然養分，可向培養基提供一定量的碳氮源，培養更易成功。同時，在培養基中添加一些輔料，如維生素B1、復合碳源（葡萄糖&土豆）等［13］，能促進蛹蟲草培養基中蟲草素的積累及菌絲的生長，調節適宜的pH有利于蛹蟲草生長［14］，較高溫度下更利于蛹蟲草中蟲草素的合成和積累［15］。本研究通過Plackett-Burman實驗篩選出添料（杜仲粉）量、培養時間、硫酸銨3個顯著影響蛹蟲草轉化杜仲培養基成分的因素，這與添加NH4+對蛹蟲草發酵產蟲草素具顯著促進作用［16］的結論相吻合。蛹蟲草利用NH4+合成谷氨酰胺，也就是核苷的間接前體，進而生成核苷［17］，而蟲草素是一種核苷類物質，由此說明為什么培養基中添加NH4+可以提高蟲草素的產量了。從微生物代謝角度分析可知，蟲草素合成的直接前體物是腺苷，腺嘌呤、次黃嘌呤等間接參與蟲草素合成［18］。本實驗中蟲草素含量增長，可能還與腺苷、腺嘌呤等化合物的含量變化有關。杜仲皮中葡萄糖類物質轉化形成松伯醇［19］，松伯醇經松脂醇合酶催化聚合生成松脂醇［20］，松脂醇在酶的作用下糖基化生產PDG［21］，從而構成杜仲PDG的生物合成途徑，該途徑中任何一個酶體系的改變都可以影響PDG的產量，本實驗利用蛹蟲草所具有的酶系去影響PDG合成途徑，使其產量發生改變。