廣東省鵝細小病毒的分離及序列分析

黃冠雄，許丹寧，楊舒展，郭斯璇，曾依翎，黃運茂，田允波，曹 楠

（1.仲愷農業工程學院動物科技學院/廣東省水禽健康養殖重點實驗室，廣東 廣州 510225；2.廣東省出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東 廣州 510623）

鵝細小病毒（goose parvovirus，GPV）是鵝和番鴨的主要病原體，對雛鵝和雛番鴨有高發病率和高死亡率［1］。 GPV屬于單鏈線性DNA病毒，具有約5 100個核苷酸，含兩個主要開放閱讀框（ORF）和末端重復序列（ITR），左側的ORF編碼主要參與病毒復制和轉錄調節的非結構蛋白，另一個ORF編碼包含VP1、VP2和VP3的衣殼蛋白，3種蛋白具有相同的C端。VP蛋白是GPV的主要免疫保護性抗原，可誘導水禽產生中和抗體［2-3］。正常情況下，由于GPV的VP基因保守性高，預防和控制GPV的主要途徑是接種疫苗［4-5］。日本［6］、英國［7］、匈牙利［8］、瑞典［9］、法國［10］和美國［11］等國家相繼報道了鵝細小病毒的發生。我國主要的水禽養殖地區，如福建［12］、江蘇［13］、四川［14］和山東［15］等也有越來越多鵝細小病毒暴發的報道。

近年來，隨著水禽養殖行業的不斷發展，GPV在廣東省的病例也越來越多。然而，廣東省已有10年沒有針對GPV進行系統的流行病學調查，無法掌握廣東省GPV流行毒株是否發生變異，也不清楚現有的GPV疫苗是否能誘導鵝和番鴨產生中和目前存在的GPV的抗體。鑒于此，我們從廣東省鵝和番鴨養殖場中收集病料并分離病毒，分析了GPV的VP基因，以研究廣東地區2016—2017年GPV的流行和變異情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在廣東省鵝主要養殖區收集被GPV感染的鵝的肝臟。通過瓊脂擴散法進行病毒抗原檢測。

1.2 病毒分離

使用Hanks緩沖液制備混合的肝臟勻漿，凍結3次，然后以10 000 r/min離心10 min。使用注射器通過0.22 μm過濾器過濾后，將每個胚胎的0.2 mL懸浮液接種到9日齡GPV陰性鵝胚尿囊腔中。每天檢查接種鵝胚存活，如果胚胎存活，則在接種后第6天收集尿囊液并匯集一起，用于接種無GPV的鵝胚胎以進一步傳代；如果胚胎死亡，則通過瓊脂擴散法測試尿囊液和內臟器官的鵝細小病毒抗原。

1.3 PCR檢測及VP基因擴增

按照病毒DNA提取試劑盒（Omega）說明書提取細小病毒DNA，應用特異鑒別引物鑒別GPV后擴增VP基因，引物如表1所示。PCR反應條件如下：95℃預變性5 min；95℃ 30 s、54℃30 s、72℃ 30 s，30個循環；72℃ 10 min。擴增后的DNA片段經1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用PCR純化試劑盒（Omega）純化PCR產物，然后送至英濰捷基公司進行測序。

1.4 氨基酸差異分析

為了確定2個分離的GPV與其他水禽細小病毒之間的序列關系，將獲得的序列與GenBank核苷酸序列數據庫中的條目進行比較。使用MEGA v5.05程序通過Clustal W方法比對核苷酸序列。

表1 GPV鑒別引物和VP基因擴增引物

1.5 系統發育分析

為了比對和分析序列，從GenBank數據庫下載了多個具有代表性的GPV序列。使用Lasergene 7.1（DNASTAR，Madison，Wisconsin，USA）編輯和分析全基因序列。采用遺傳分析軟件MEGA 5.05用ML方法繪制VP基因發育進化樹。

1.6 正負選擇地點的估計和選擇壓力

為了全面估計GPV VP基因的選擇壓力，通過Datamonkey數據分析網站，使用SLAC、FEL和IFEL方法計算每個密碼子的非同義（dN）和同義（dS）替換率［16］，2種或2種以上方法預測氨基酸位點同為陽性或陰性方才有效。如果P值<0.05則判定為陽性（dN> dS），反之則為陰性（dN

2 結果與分析

2.1 GPV的分離鑒定及VP基因的擴增

將采集的病料處理后接種鵝胚，發現有2份采集的病料3～6 d內有死胚現象，對照生長發育正常。收集鵝胚的尿囊液，提取DNA后進行PCR并電泳。從圖1可見，2份致死鵝胚的病料在400 bp左右出現條帶，而陰性對照沒有條帶。將2株GPV分離株分別命名為GDQY2017和GDYJ2017。

利用VP基因擴增引物擴增得到PCR產物，經電泳后，在2 000 bp左右出現與預期大小相符的片段（圖2）。

圖1 GPV鑒別PCR結果

圖2 GPV VP基因PCR擴增結果

2.2 2株GPV分離株 VP基因的系統發育分析

從GenBank中下載中國大陸和其他國家及地區報道的水禽細小病毒的完整VP基因，與本研究分離的2株GPV進行序列分析并繪制VP基因的系統進化樹。結果（圖3）顯示，水禽細小病毒明顯分為兩個遺傳譜系，一個是從鵝和鴨中分離的鵝細小病毒（GPV），另一個是番鴨細小病毒（MDPV）。此外，來自不同地區和不同采集時間的GPV呈復雜化，GPV聚集成不同的遺傳群體。 鴨源GPV毒株（KT343253和KT751090）和減毒GPV毒株（KX384725）形成不同于經典GPV毒株的進化譜系。歐洲分離株和亞洲分離株也分別形成不同的譜系。目前的GPV疫苗株（GD、GDaGPV和SYG61v）共同形成一個單獨的進化分支。值得注意的是，本研究從廣東分離到的2株GPV毒株形成一個單獨的分支，與廣東原始GPV株GDFSh以及GPV疫苗株SYG26-35、GDaGPV和SYG61v不在同一分支上。

2.3 選擇壓力分析

預測鵝細小病毒VP基因的dN/dS值，以確定本研究的2株GPV分離株在選擇壓力下陽性位點的數量和位置，如圖4所示，dN/dS比率為0.145474，116位點為陽性選擇位點（氨基酸變化：Arg → Gln）。

2.4 2株GPV分離株與GPV疫苗株的VP氨基酸序列比較

GPV的毒力和抗原性與VP蛋白的氨基酸序列有關。從表2可以看出，2株分離的GPV毒株只有2個氨基酸存在差異，表明這2株病毒的相似性很高。然而，與3種疫苗株相比，這5種病毒總共有22個氨基酸殘基差異，其中15個位于VP3蛋白中。雖然GPV的受體結合位點（Asn-489和Asn-650）沒有發生變異，但是位于受體結合位點附近的476、637氨基酸位點處的變化可能影響現有的GPV疫苗對流行毒株的防控效果。此外，值得注意的是，本研究分離的2株GPV毒株在116位點的氨基酸與3株GPV疫苗株均不同。考慮Arg116Gln是陽性選擇位點，這可能是現有的GPV疫苗不能完全保護水禽的原因。本研究中分離的2株GPV與疫苗株相比沒有發生糖基化位點數量和位置的改變。

3 討論

鵝細小病毒病是引起雛鵝和雛番鴨高致病率和高致死率的重要疾病，預防和控制鵝細小病毒的主要方式是對種鵝接種滅活疫苗。然而，接種了疫苗的鵝和番鴨體內產生的抗體滴度不足以傳遞給雛鵝或雛番鴨，這可能是鵝細小病毒廣泛流行的原因［9，12，17］。廣東省 GPV 疫情逐年增加，造成巨大的經濟損失。這一現象表明，廣東省的鵝細小病毒疫苗可能并不足以保護水禽。

圖3 水禽細小病毒VP基因的系統發育樹

圖4 鵝細小病毒VP基因點對點選擇壓力分析結果

表2 2株GPV分離株和3株GPV疫苗株氨基酸差異

VP是鵝細小病毒的結構蛋白，VP3是鵝細小病毒衣殼蛋白的主要成分，也是主要的保護性抗原，可以刺激水禽產生抗體。本研究中，廣東地區分離的2株GPV和3株GPV疫苗株中，大多數氨基酸突變發生在VP3蛋白中。從系統發育分析的結果可知，2株GPV分離株具有高度同源性，形成一個單獨的遺傳分支，并且與GPV疫苗株（SYG61v、SYG26-35和GDaGPV）和GPV毒力B株進化關系較遠。這可能由于廣東省內居民具有偏喜歡消費本地鵝種的特殊飲食習慣，導致當地品種鵝在省內廣泛交易，從而使得GPV在廣東省內廣泛流行，并且單獨形成了一個遺傳演化譜系。

細小病毒衣殼表面上的凹痕或突起負責識別受體［18］，而糖脂、聚糖和糖蛋白可作為受體協助細小病毒進入宿主細胞［1］，這意味著氨基酸的變化可能導致蛋白質空間結構或理化性質的改變，從而使得病毒不能進入宿主細胞內［19］。AAV-2的VP蛋白中的5種氨基酸（Arg-484，Arg-487，Lys-532，Arg-585和Arg588）是其受體結合位點［20-21］，而 GPV 的VP蛋白與AAV-2相似度高，因此GPV在484、487、532、585、588位點的氨基酸變化或這5個位點附近的氨基酸變化可能導致GPV毒力的變化［22］。Fan 等［1］研究表明，鵝細小病毒在 489位的突變可能使鵝細小病毒的宿主從鵝擴展到鴨的原因。

一般而言，由于病毒可能經歷強烈的選擇壓力，使得病毒蛋白質中存在陽性選擇位點［23］。本研究分離的2株GPV在Arg116Gln的變化可能是由疫苗接種或其他因素的選擇壓力導致的，這可能造成疫苗產生的抗體不能識別及中和病毒，甚至在接種疫苗后也導致免疫失敗。本研究結果為中國東南部養鵝行業疫苗的廣泛失效提供了解釋［28］。

綜上所述，本研究利用系統發育分析方法分析了2株廣東GPV毒株及其他水禽細小病毒毒株的完整VP基因序列，證實廣東GPV進化為僅在廣東省流行的新遺傳群，GPV的進化和突變導致抗原結合位點之間氨基酸殘基改變，這可能導致目前市場流通的GPV疫苗無法預防和控制水禽GPV的流行。因此，應適時選擇候選GPV毒株進行疫苗生產，特別是在某個地理區域。