紫花苜蓿幼苗莖葉響應鹽脅迫的雙向電泳比較分析

熊軍波，劉 洋，田 宏，張鶴山，陳明新

(湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是全球栽培面積最大的多年生豆科牧草，具有高產優質等特性，是公認的“牧草之王”。紫花苜蓿適宜生長在中性偏堿性的土壤環境中，具有中等耐鹽堿性，在電導率為0.0～2.0 dS/m的鹽堿性土壤中能正常生長，超過此范圍，電導率每上升1 dS/m，產量下降7%[1]。根據聯合國糧食與農業組織(food and agriculture organization，FAO)的估算，全世界約有3 400萬hm2(灌溉面積的11%)受到不同程度的鹽漬化影響[2]。據國家農業部組織的第2次全國土壤普查資料統計，我國現有鹽漬土的面積為3 467萬hm2(不包括濱海灘涂)，其中已開墾種植的為576.8萬hm2。如何提高紫花苜蓿在鹽堿土壤中的產量，一直是國內外苜蓿工作者關注的重點。

土壤鹽堿化是由一系列離子共同構成的，包括NaCl、Na2SO4、MgSO4、CaSO4、MgCl2、KCl和Na2CO3等，NaCl是最主要的鹽分構成，目前大部分研究都是圍繞NaCl脅迫展開的[3-4]。高濃度的NaCl會引起植物水分缺失、離子毒害、營養失衡、氧化脅迫等，而導致植物生長減緩，甚至死亡[5]。生理生化研究表明，紫花苜蓿通過形態學改變、加強活性氧清除、合成滲透物、離子選擇吸收、隔離和外排、改變細胞壁和細胞膜結構等措施以適應鹽脅迫[6]。這些適應性調節機制與鹽脅迫下紫花苜蓿基因網絡的特異性表達密切相關，采用各種高通量技術，已經鑒定出大量鹽脅迫響應基因[7-8]。這些研究從轉錄組水平初步揭示了苜蓿響應鹽脅迫的代謝網絡，然而基因從轉錄到最后表達成蛋白行使功能，中間受到復雜的翻譯后修飾、蛋白質的亞細胞定位、蛋白-蛋白相互作用等調控，因此非常有必要從蛋白質水平進行深入研究。

蛋白質組學從整體角度分析細胞內動態變化的蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律的一個新的研究領域。近年來，國內外研究者采用蛋白質組學方法對超過34種植物的葉片、根、莖、幼苗、單細胞、種子、子葉下胚軸、花序等組織響應鹽脅迫的蛋白質組進行研究，成功鑒定出超過 2 171個鹽脅迫響應蛋白質[9]。本研究擬選取耐鹽紫花苜蓿品種中苜1號為材料，使用雙向電凝膠電泳(2-DE)和質譜鑒定技術對紫花苜蓿幼苗地上部(莖葉)在響應鹽誘導時差異表達蛋白進行篩選和鑒定，采用生物信息學方法對差異蛋白的功能和參與的代謝途徑進行分析，以期尋找到紫花苜蓿響應鹽脅迫應答機制中存在組織異性的調節機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿中苜一號種子由中國農業科學院畜牧研究所牧草研究室提供。挑選籽粒飽滿、無病蟲害的種子，用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，然后用蒸餾水沖洗3次。清洗的種子用蒸餾水浸種12 h后，放置于濕潤的濾紙中培養3 d。之后將幼苗移入1/2 Hoagland營養液中進行水培，6 d后開始脅迫。將培養的幼苗分為2組：一組在1/2 Hoagland營養液中培養；另一組在1/2 Hoagland營養液中添加50 mmol/L NaCl適應生長24 h，其后放入濃度為200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養液培養。每2 d更換1次培養液，其間不定時攪拌，培養9 d后同時收割2組苜蓿地上部(莖葉)，液氮保存。

1.2 藥品與試劑

固相pH值梯度干膠條、IPG緩沖液、雙向電泳蛋白洗滌液(2D clean-up)試劑盒、雙向電泳蛋白質定量(2D-quant)試劑盒、尿素(urea)、甘氨酸、兩性表面活性劑(CHAPS)、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(bis-acrylamide)、過硫酸銨(AP)、干膠條覆蓋液(礦物油)，均購自Amersham Biosciences；碘乙酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、四甲基乙二胺(TEMED)購自Sigma公司；溴酚藍、蛋白marker、碳酸鈉、乙酸鈉、硫代硫酸鈉、EDTA二鈉鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、低熔點瓊脂糖購自BBI(Bio Basic Inc，加拿大)；其他試劑為國產分析純。所有溶液均用Milli-Q制備的純水配制。

1.3 總蛋白質的提取和定量

蛋白質提取參照Xiong等的方法[10]，部分進行調整。稱取0.5 g樣品加入液氮研磨后，轉入離心管加入3 mL TRIzol(2% DTT)，振蕩混勻，加入0.6 mL三氯甲烷，振蕩混勻，放置 5 min；4 ℃、15 000 r/min離心10 min，去上清，添加 0.9 mL 無水乙醇，振蕩混勻，放置5 min；4 ℃、15 000 r/min離心5 min，取上清，加入4.5 mL異丙醇，振蕩混勻，4 ℃放置5 min；此后4 ℃、15 000 r/min離心10 min，去上清，用6 mL含 300 mmol/L 鹽酸胍的95%乙醇洗滌沉淀3次；4 ℃、15 000 r/min 離心10 min，留沉淀，用6 mL無水乙醇洗滌1次，冷凍干燥。其后加入裂解液[8 mol/L尿素、20 mg/mL CHAPS、10 mg/mL DTT、0.5% IPG緩沖液(pH值為4～7)和0.02 mg/mL溴酚藍，超聲20 min促溶，4 ℃靜置4 h以上，離心沉淀(4 ℃、40 000 r/min)1 h，吸取上清備用。使用2D-quant試劑盒對蛋白質進行定量分析，步驟按試劑盒說明進行。

1.4 等電聚焦電泳和SDS-PAGE電泳

使用水化液[8 mol/L尿素、20 mg/mL CHAPS、10 mg/mL DTT、0.5% IPG緩沖液(pH值4～7)和0.02 mg/mL溴酚藍]稀釋蛋白質溶液，最終將0.27 mg/mL蛋白質溶液上樣到 24 cm、pH值4～7的IPG膠條上。等電聚焦在Ettan IPGphor Ⅱ(GE Healthcare)儀器上進行，溫度設置為20 ℃，程序為：30 V，12 h；150 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，2 h；8 000～40 000 V·h。等電聚焦后膠條立即平衡，首先在含有平衡液[6 mol/L尿素、300 mg/mL甘油、20 mg/mL SDS、50 mmol/L Tris-HCl，pH值8.8，10 mg/mL DTT]的平衡液管中水平放置15 min，其后換入含有平衡液的管中水平放置 15 min。平衡后的膠條轉移到12% SDS-PAGE凝膠中進行二向分離，首先在電泳液(250 mmol/L Tris-base、1.92 mol/L甘氨酸和 10 mg/mL SDS)中0.2 W/膠條運行1 h，其后相同環境中使用15 W/膠條運行到結束。每組試驗設置4次組內重復。

1.5 蛋白染色和圖像分析

凝膠選用銀染，方法參照GE handbook作適當修改。凝膠首先在含有40%乙醇、10%乙酸的水溶液中固定1 h，其后使用含有30%乙醇、2 mg/mL硫代硫酸鈉和6.8%乙酸鈉溶液中敏化30 min。經超純水漂洗3次，每次5 min；后轉入含有2.5 g/L硝酸銀溶液中銀染20 min，其后使用超純水漂洗2次，每次1 min；轉入顯色液(25 g/L碳酸鈉、240 mL/L 甲醛)中顯色2次：第1次1 min，第2次4 min。反應完后轉入含有1.46% EDTA的溶液中10 min終止反應，最后使用純水漂洗3次，每次5 min。染色完成的膠用Powerlook 2100XL掃描儀掃描，并使用ImageMasterTM2D Platinum 6.0軟件分析，包括凝膠圖像的背景消除、點確認、定量和點的匹配等，選取蛋白質相對表達量差異達2倍以上的蛋白質點進行質譜分析。

1.6 蛋白質譜鑒定

根據ImageMaste分析軟件結果挖取差異蛋白質點，委托華大基因進行基質輔助激光解吸/電離飛行時間串聯質譜(MALDI-TOF-TOF/MS)分析。將所得到的肽片段質量數據運用MASCOT軟件進行在線檢索(http：//www.matrixscience.com)，選取NCBI數據庫作為檢索數據庫。鑒定成功的蛋白質點根據aimGo數據庫(http：// www.geneontology.org/)功能注釋進行分類統計。

2 結果與分析

2.1 雙向電泳凝膠圖譜分析和質譜鑒定

分別提取對照組和處理組地上部分蛋白質進行雙向電泳，電泳圖譜見圖1。基于ImageMaster圖像軟件分析，每張 2-DE膠上約可檢測到900多個蛋白質點，其中對組照凝膠上(0 mmol/L NaCl)凝膠上有(907±31)個蛋白質點，而處理組(200 mmol/L NaCl)凝膠上有(914±23)個蛋白質點，2個試驗組內變異系數都在5%以內。對其蛋白質點分布分析表明，大多數蛋白質點集中在等電點為5～7，分子量為38～90 ku。軟件匹配和手工匹配相結合，2種處理的蛋白質匹配成對的有817對。豐度分析表明，有20個蛋白質點相對豐度發生2倍以上變化，可以重復，蛋白質點輪廓清晰可見，同時在分析時去掉了可能的生物學影響及膠本身的影響。其中13個在鹽脅迫下表達量下調，7個表達量上調。差異表達蛋白質點廣泛分布于雙向圖譜中，部分蛋白質點局部見圖2。

2.2 差異表達蛋白的質譜分析和功能分類

選取全部差異表達蛋白進行MALDI-TOF-TOF/MS分析，Mascot軟件搜索NCBInr和SWISSPROT數據庫GreenPlants進行匹配，14個匹配成功(表1)?；赼imGo數據庫功能注釋，將這些蛋白的功能分為以下幾類：Ⅰ類，參與光合作用蛋白。共4個蛋白質，包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(編號4)、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基(編號3)、苯醌質體藍素還原酶(編號13)、葉綠體放氧增強蛋白1(OEE1，編號5)。Ⅱ類，脅迫防御類蛋白。共2個蛋白，包括谷胱甘肽過氧化物酶1(編號9)和抗病相關蛋白2(編號7)。Ⅲ類，碳水化合物代謝相關蛋白。共2個蛋白，包括3-磷酸甘油醛脫氫酶(編號12)和蔗糖合酶(編號1)。Ⅳ類，轉錄調控和信號傳導相關蛋白。共2個蛋白，包括液泡的鈣結合相關蛋白(編號14)和真核翻譯起始因子5A-2(編號8)。Ⅴ類，生長發育調控蛋白。共2個蛋白，包括細胞分裂周期蛋白48(編號11)和F-box家族蛋白(編號10)。Ⅵ類，次生代謝相關蛋白。共2個蛋白，包括硫腺苷甲硫氨酸和酶(編號6)和丙二烯氧化環化酶2(編號2)。

表1 鹽脅迫下紫花苜蓿差異表達蛋白的串聯質譜鑒定結果

續表1

編號匹配蛋白名稱(物種)NCBI登錄號理論分子量Ku/等電點測定分子量Ku/等電點得分匹配肽段數(個)相對表達量7抗病相關蛋白2(PR2)[紫花苜蓿]2226600116.5/5.836/6.834448真核翻譯起始因子5A-2(eIF-5A-2)[海島棉]4564451017.2/5.235/4.5112311細胞分裂周期蛋白48(CDC48)[擬南芥]184149390.6/5.034/4.940761蔗糖合酶(SS)[紫花苜蓿]316954492.6/5.820/4.375310F-box家族蛋白[擬南芥]1523626658.2/9.6886.0984

注：“相對濃度”一欄中，1表示對照，2表示處理。

3 討論

3.1 光合作用和碳水化合物代謝相關蛋白質

鹽脅迫下，植物的光合作用首先受到影響[11]。在鑒定的差異表達蛋白中有4個蛋白參與到光合作用過程中，其中苯醌質體藍素還原酶(PPR)和放氧增強蛋白1(OEE1)參與光合作用中的光反應階段。OEE1是光系統Ⅱ(PSⅡ)中放氧復合體的2個亞基之一，靠近類囊體腔的一側，參與水的裂解和氧的釋放[12]。體外試驗也證實了OEE1能催化水氧化為氧分子，且當OEE1表達量下降時，PSⅡ的活性下降16%～40%[13]。PPR參與質體藍素的合成，質體藍素為細胞色素復合體與PSⅠ之間的電子傳遞中介受體[14]。在本研究中2個光反應相關蛋白表達量下降，必將導致光反應向暗反應提供能量的減少。研究還發現，暗反應關鍵調節酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)大小2個亞基表達量發生變化。RuBisCO催化暗反應的碳固定，將大氣中游離的CO2轉化為生物體內儲能分子，同時也是光呼吸催化酶。高等植物中RuBisCO是由8個大亞基和8小亞基組成的寡聚體，在植物葉片內的含量很高，約占可溶性蛋白質的50%以上[15]。有研究表明，RuBisCO亞基表達量改變與活性氧導致的RuBisCO的降解相關[16]。

鹽脅迫下，植物水分吸收受阻，為了減少水分蒸發，植物通過減小葉片面積、關閉氣孔以適應鹽脅迫環境。葉片面積減少會導致光反應速率受到影響，在本研究中鑒定的光反應相關蛋白表達量下降，與這些生理現象相關。同時，氣孔的閉合將直接導致CO2的吸收和同化減少，RuBisCO的降解必然會導致碳素化合物合成減少，而對后續的碳水化合物正常生理代謝產生影響。在本研究中發現蔗糖合成酶(SS)與甘油醛-3-磷酸酶(GAPDH)2個參與碳水化合物代謝的酶表達量下降。其中，SS是植物體內蔗糖合成和分解的關鍵酶，直接調控蔗糖在由“源”向“庫”的運輸，同時也是蔗糖進入各種代謝途徑的關鍵酶[17-18]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是高等植物糖酵解、糖異生和卡爾文循環過程中的關鍵酶，催化甘油醛-3-磷酸形成1，3-二磷酸甘油酸的可逆反應，是糖酵解(糖異生)中唯一的氧化(還原)反應，催化依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)，將3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油酸，同時伴有還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)生成的不可逆反應[19]。這2個蛋白質表達量的下降，進一步表明鹽脅迫對碳水化合物的合成代謝產生影響。

3.2 脅迫防御蛋白相關蛋白質

當植物在受到真菌、細菌和病毒等病原體入侵或受到非生物脅迫時會產生和積累病程相關(PR)蛋白，PR蛋白的誘導已在多種植物中發現，它是植物自我防御機制中的可誘導組分。PR蛋白根據其作用和功能分為17個家族，其中PR2蛋白屬于β-1，3-葡聚糖酶家族，其以探明的功能包括水解真菌性病原菌的細胞壁，參與植物生長發育的各個階段的調控[25]。在本研究中鹽脅迫下莖葉中PR2蛋白表達量上升，在此前的研究中還未發現該蛋白響應鹽脅迫的誘導。

3.3 次生代謝相關蛋白質

本研究中鑒定出5-腺苷甲硫氯酸合成酶(SAMS)和丙二烯氧化環化酶2(AOC2) 2個參與到激素合成次生代謝蛋白表達量發生改變。其中，SAMS參與催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成，而SAM是植物體內一個普遍的甲基供體，也是乙烯生物合成的前體。對SAMS的研究表明其在植物逆境生理、衰老生理、植物生物代謝及其調控研究上均具有重要的意義。在本研究中SAMS蛋白質表達量下降，這與此前在擬南芥根中的研究結果[26]一致。丙二烯氧化環化酶2(AOC2)是茉莉酸(jasmonic acid，JA)合成前體，植物JA作為一種信號分子，參與誘導氣孔關閉，抑制Rubisco生物合成，影響植物對N、P的吸收，葡萄糖等有機物的運輸以及生物脅迫的應急反應調控等[27]。對AOC基因功能研究表明，在番茄中轉入外源的AOC能提高其抗鹽堿能力[28]。此前研究還表明，在鹽脅迫條件下，該蛋白質在耐鹽植物鹽芥中表達量上升，而在敏鹽植物擬南芥中表達量下降，表明該蛋白質的表達量可能與耐鹽調節相關[29-30]。在本研究中AOC2蛋白質表達量上升，可能對紫花苜蓿耐鹽調節有重要作用。

3.4 轉錄調控和信號傳導相關蛋白質

植物感受到外界環境刺激，通過特定的受體將這一信號傳遞到細胞核，并誘導相關基因的表達來適應外界環境，此過程受到復雜的轉錄、翻譯和剪切修飾等調控。Ca2+是植物體內重要的信號分子，在受到多種脅迫時都會誘導細胞基質中鈣離子濃度變化(Δ[Ca2+]cyt)，特定的膜聯蛋白質(annexins)通過結合Δ[Ca2+]cyt而進行信息傳遞[31]。Δ[Ca2+]cyt濃度的增加被一種鈣依賴磷酸酶(calcineurin B-like protein CBL4)所感應，通過磷酸化激活特定的蛋白質，從而啟動到后續調節反應。此后，[Ca2+]cyt由通過Ca2+通道、Ca2+結合蛋白對鈣的緩沖等降低細胞基質中Ca2+含量。在本研究中液泡鈣離子結合相關蛋白質(vacuolar calcium-binding protein-related)在Ca2+通道中起到緩沖[Ca2+]cyt的作用，在鹽脅迫下表達量上調。

eIF-5A為真核細胞蛋白轉譯起始因子，普遍存在于真核生物和原始細菌中。研究表明，它是目前自然界中唯一一種含有特殊氨基酸8-羥基2,7,10-三氨基癸酸(hypusine)的蛋白質，eIF-5A只有通過hypusine化修飾后才能行使其功能，與經典的轉錄起始因子不同的是，eIF-5A并非所有蛋白質翻譯所必需的因子[32]。研究還證實，eIF-5A與細胞中的許多生命活動有關，如細胞增殖、蛋白質翻譯、mRNA降解、細胞周期的轉化及細胞衰老與凋亡等[33]。對擬南芥eIF-5A家族成員的分析表明，不同家族成員參與的轉錄調控與植物的不同生理防御相關，其中eIF-5A-2參與擬南芥受到病毒感染和傷害后的信號傳導，并通過細胞分裂素信號通路調控擬南芥根木質部的發育，在細胞的分裂、生長和死亡中發揮著重要作用[34]。本研究中eIF-5A-2表達量下降，表明該蛋白質也參與到鹽脅迫調節中。

3.5 生長發育調控相關蛋白質

泛素-蛋白酶途徑在細胞周期控制、晝夜節律、花的發育和激素信號轉導等許多細胞過程中都發揮著關鍵作用。在該途徑中，泛素標記單細胞發育過程中不需要的蛋白質被蛋白酶26S降解，從而調控細胞的發育和分化[35]。本研究鹽脅迫下，莖葉中1個F-box家族蛋白和1個細胞分化周期蛋白質表達量都下降，且都與泛素-蛋白酶途徑相關。F-box家族蛋白質通過與Skp1p-cullin結合形成Skp1p-cullin-Fbox (SCF)蛋白質復合體，該復合體蛋白質能識別目標降解蛋白質，從而調控細胞分化、細胞周期、轉錄調控和信號傳導等過程[36]。在植物體中，CDC48蛋白質參與紡錘體的分解、泛素結合蛋白質的分解和蛋白質從內質網膜到細胞質的運輸[37-38]。鹽脅迫下，苜蓿的生長發育減緩，這2個蛋白質表達量的下降也反映了該生理過程。

4 結論

差異蛋白質組學通過比較植株細胞在不同生理調節下蛋白質的差異表達，對相關蛋白質進行鑒定和分析，從蛋白質組學水平揭示植物在適應脅迫環境中的調節機制。本研究將差異蛋白質組學技術運用于紫花苜蓿鹽脅迫適應機制的研究中，分別提取對照和鹽脅迫環境中紫花苜蓿地上部蛋白質，應用雙向電泳技術進行分離，通過雙向電泳太圖譜分析軟件分析，獲得圖譜中20個點豐度發生2倍以上變化，采用串聯質譜成功鑒定出14個差異表達蛋白質，應用生物信息學方法并結合植物生理學，對這些差異蛋白所參與的代謝途徑及其作用機理進行分析。結果表明，這些蛋白質主要參與光合作用、脅迫防御應答、碳水化合物代謝、轉錄調控和信號傳導、細胞分化和次生代謝。