最小體積法玻璃化保存的研究進展

(上海理工大學醫療器械與食品學院 上海 200093)

低溫環境下，細胞或組織的代謝活動會削弱甚至完全停止。低溫環境為細胞、組織的長期有效儲存提供條件，使其可廣泛應用于組織工程、再生醫學和輔助生殖等多個領域[1]。目前實現細胞低溫保存的方法有慢速冷凍法和玻璃化法。慢速冷凍法于20世紀70年代早期出現，它是先將凍存管放在程序降溫盒中以1～2 ℃/min的降溫速率緩慢降至某一中間溫度，然后置于液氮中保存。慢速冷凍法需要1～2 mol/L[2]的低溫保護劑(cryoprotectant agents，CPAs)，冷凍過程中易形成冰晶，冰晶對細胞結構具有破壞作用[3]，保存效果不理想。玻璃化是將液體直接轉化為非晶態(玻璃態)的固體，在此過程中無冰晶形成。與慢速冷凍法相比，玻璃化法需要更高的CPAs濃度，如6～8 mol/L，以及更高的降溫速率，如105℃/min[4]。

實現玻璃化有兩種方法，一種是提高CPAs濃度，另一種是提高冷卻速率。高濃度CPAs會對細胞造成滲透休克及毒性損傷，具有致命性損傷[4]，因此該方法有較大的局限性。研究表明，實現玻璃化過程中，降溫速率與保護劑濃度間存在一定對應關系，降溫速率越高，實現玻璃化所需要的CPAs濃度越低。理論顯示，當冷卻速度大于106℃/s時，甚至純凈水也可以實現玻璃化[5]。提高降溫速率有兩種方法：1)提高傳熱系數，如將液滴直接噴入液氮中或優化載體傳熱特性。Y. S. Song等[6]發現液滴與液氮直接接觸時，液滴表面易形成一層氮氣膜，這層薄膜會降低熱傳遞效率，降溫速率并未得到明顯提升。采用優化載體傳熱特性的方法，如石英毛細管法，對胚胎干細胞玻璃化，降溫速率高于105℃/min，在較低的CPAs濃度下，如2 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖即可實現玻璃化[5,7-8]；2)通過降低微滴體積提高降溫速率。研究表明，當微滴尺寸降低至0.1 uL時,微滴從表面到中心的降溫速率均超過105℃/min[9-10]，能成功實現玻璃化。

最小體積法玻璃化保存，即通過降低微滴體積實現玻璃化。微滴體積足夠小時，可顯著提高降溫速率，減少玻璃化所需的CPAs濃度，有助于提高保存后細胞的活性和功能。本文綜述了最小體積法玻璃化保存的最新研究進展，包括有載體的微滴玻璃化保存、噴射微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存、微流體封裝微滴玻璃化保存。其中，噴射微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存及微流體封裝微滴玻璃化保存，是將新型的微滴產生技術與玻璃化保存技術相結合。因其能迅速產生大小均勻的微滴，具有高通量的特點[9-11]，在低溫保存領域具有很好的發展前景。

1 有載體的微滴玻璃化保存

目前，最小體積法玻璃化保存的研究大都集中于有載體的微滴玻璃化保存，如開放式拉伸麥管法(open pulled straw，OPS)[1]，半麥管法(Hemi-straw)[8]，冷凍環法(Cryoloop)[8]，石英毛細管法(quartz microcapillary，QMC)[3]，Cryotop法[8]，電鏡銅網法(electron microscopic grids，EMG)[12]等，如圖1所示?；谳d體的微滴玻璃化保存需靠載體影響傳熱，因此載體的選擇至關重要，通常選導熱性良好的材質。通過合理設計載體幾何結構，使所容納的冷凍液體積盡可能少，以提高降溫速率。如EMG是以銅紗網作為冷凍載體，冷凍時，將小于1 uL含細胞的微滴滴在銅紗網上，然后將其直接投入液氮中以實現高的冷凍速率，冷卻速率約為3 000 ℃/min[13]。OPS[14]是利用虹吸原理將含有細胞的微滴吸入拉伸麥管細端，然后快速投入液氮中進行冷凍，降溫速率約16 000 ℃/min。Hemi-straw是將0.25 mL的麥管開口端剪成長1 cm，寬0.5 mm的薄片，冷凍時將含有細胞的冷凍液直接移到薄片上，該方法克服了OPS易漂浮的缺點。由于冷凍液與液氮接觸面增加，降溫速率明顯提升，超過20 000 ℃/min[12,15-16]。Cryotop采用一個很窄的塑料薄膜帶作為冷凍載體，連接一根硬塑料桿作為手柄，并帶有一個安全帽。冷凍時，含有細胞的微滴被加載在薄膜帶上，然后用毛細管將細胞周圍的溶液全吸走，直到留一層薄薄的膜足夠覆蓋細胞，迅速插入液氮冷凍。采用這種方法降溫速率可達40 000 ℃/min[17-19]。QMC是選取傳熱速率更好的石英材料制作微管，管外徑為0.2 mm，厚度為0.01 mm，可實現更快的降溫速率，超過250 000 ℃/min[5]。 Cryoloop是借助表面張力在尼龍線圈上形成一層冷凍液薄膜，由于缺少固體物的支持，樣本降溫速率高達700 000 ℃/min[20-21]。

(a)拉伸麥管法OPS[1]；(b)半麥管法Hemi-straw[8]；(c)冷凍環法Cryoloop[8]；(d)石英毛細管法QMC[3]；(e)Cryotop法[8]；(f)電鏡銅網法EMG [12]。圖1 有載體的微滴玻璃化保存方法Fig.1 Methods of carrier-based droplets vitrification preservation

有載體的微滴玻璃化保存主要應用于卵母細胞和胚胎的玻璃化保存。采用不同載體玻璃化保存的結果，如表1所示?？芍ＡЩ４媛涯讣毎麜r，不同載體對卵母細胞的保存效果有很大差異。如 M. Kuwayama等[17-18]對牛卵母細胞玻璃化保存，相較于OPS，采用Cryotop保存的卵母細胞受精率和囊胚發育率更高，且紡錘體結構和染色體形態更正常。J. K. Choi等[22]采用QMC玻璃化保存卵母細胞，相較于采用Hemi-straw[16]，所用的CPAs濃度降低，且保存后卵母細胞的發展潛力更大。有載體的微滴玻璃化保存也可用于干細胞等小體積細胞，如He Xiaoming等[5]采用QMC玻璃化保存鼠胚胎干細胞。但每次僅可對少量的細胞進行玻璃化保存，且均需手動操作，對用于再生醫學和組織工程等臨床需求量較大的細胞，有載體的微滴玻璃化保存方法往往不可行，應用范圍受限。

表1 有載體的微滴玻璃化保存結果Tab.1 The results of carrier-based droplets vitrification

注：表中v/v為體積分數，w/v為質量濃度。

2 噴射微滴玻璃化保存

噴射微滴玻璃化保存，是利用裝置的噴嘴將含有細胞的懸浮液離散成微滴，然后在液氮中進行玻璃化保存。采用此方式噴射出的微滴呈無序狀態。U. Demirci等[23-26]曾提出采用聲學驅動微機械噴射器產生液滴，該噴射陣列的每個元素均由一個彎曲單晶硅圓薄膜構成，膜中心刻蝕一個孔。通過聲波驅動壓電換能器，使膜發生共振位移，即可噴射出微滴。采用該裝置進行水噴射實驗，在0.47、1.24、2.26 MHz頻率下操作，產生的液滴直徑相應為6.5、5.0、3.5 μm。該裝置產生的微滴尺寸微小，但缺點是當噴射液體濃度增大時易導致噴嘴堵塞。隨后，U. Demirci等[27]又提出一種開放式無噴嘴噴射系統。該裝置由交錯的金屬環按需產生聲波，聲波在微流道中空氣和流體之間的界面聚焦，產生液滴。該裝置可產生直徑約37 μm的微滴，成功應用于胚胎干細胞、成纖維細胞、AML-12肝細胞、人類Raji細胞和HL-1心肌細胞等不同類型細胞，且噴射后細胞活性均超過89.8%。裝置每秒可生成10 000個微滴，具有高通量特點。但是由于該裝置為開放式聚焦，聲波不宜形成徑向耦合，因此不利于穩定噴射。

J. Samot等[28]提出了納升級噴射微滴玻璃化保存系統。該系統由氮氣流輸送裝置、已加載CPAs的細胞懸浮液注射裝置、薄膜收集裝置三部分構成。噴嘴由200 μL移液槍頭和27G斜口針頭制作而成。其制作步驟是，距槍頭尖端2 cm處從側面插入27G針頭，槍頭尖端切去2 mm，針頭露出尖端2 mm。槍頭敞口端連接內徑3.2 mm的連接管輸入氮氣流；27G針頭端輸入已加載好CPAs的細胞懸浮液，懸浮液注射速度由微注射泵控制。進行噴射實驗時，由氮氣流和含有細胞的懸浮液構成共流，利用氮氣流將含有細胞的懸浮液吹打成微滴。產生的微滴用直徑8.5 cm聚乙烯薄膜接收，然后用鑷子夾取薄膜放入液氮中進行玻璃化。R. E. Assal 等[29]將該系統應用于紅細胞玻璃化保存，研究氮氣流速、懸浮液注射速度、聚乙烯薄膜接收位置三個參數對微滴大小的影響。發現當氮氣流速設置為3 L/min、注射泵流速設置為200 μL/min、聚乙烯薄膜距噴嘴6～9 cm處時，此時收集到的液滴尺寸最小，微滴直徑(55±14) μm。然后將噴有微滴的聚乙烯薄膜浸入無菌液氮中進行玻璃化保存，結果顯示，在低濃度保護劑4.5%(v/v)四氫嘧啶中，含有紅細胞的微滴即可實現玻璃化，且復溫后細胞活性較高。Zhang X.等[30]將該系統應用于卵母細胞保存，實現了卵母細胞的玻璃化保存。當實驗條件設置氮氣流速為0.8 L/min時，可產生最優尺寸的液滴，直徑為(140±58) μm。結果表明，減小微滴體積能降低玻璃化保存時所需的CPAs濃度，在1.4 mol/L乙二醇、1.1 mol/L DMSO和1 mol/L蔗糖條件下，即可實現卵母細胞玻璃化。采用該系統保存卵母細胞，細胞存活率較高，且孤雌激活后分裂率達96%，囊胚率達26%。

噴射微滴玻璃化保存系統產生的微滴足夠小，將其直接噴入液氮，降溫速率可明顯提升。冷卻速率超過105℃/min，是塑料麥管冷凍速率的40倍?？擅黠@降低玻璃化保存時所需的CPAs濃度，避免了高濃度保護劑對細胞造成的滲透損傷和毒性損傷。然而，該系統尚存在不足之處，如R. E. Assal等[29]提出的系統，僅用一個直徑為8.5 cm的聚乙烯薄膜接收含紅細胞的液滴，每次能夠處理的細胞量僅為80 μL。若單次接收時間過長，則會造成微滴疊加，微滴體積的增大不利于玻璃化保存。Zhang X.等[30]采用噴射微滴玻璃化保存卵母細胞時，易造成細胞丟失。

3 生物打印微滴玻璃化保存

生物打印技術是對生物材料，如活細胞、生長因子、基因、藥物等進行打印的一種技術，可產生有序微滴。按驅動機制不同，可分為壓電噴墨打印、熱式打印、基于閥門打印、激光直寫打印、激光轉移誘導打印等。現已成功應用于組織三維重建、再生醫學移植和診斷、藥劑學及高通量篩選、癌癥研究等[31]多個領域，并已逐步拓展到醫用低溫保存領域。

基于生物打印技術，Xu Feng等[32]自主設計細胞打印機。該打印機以氣動壓力作為驅動機制，通過調節電磁閥開啟時間來控制微滴大小。實驗采取160滴每秒的速度對胚胎干細胞進行打印，通過合理控制液滴尺寸、細胞濃度及培養時間，最終形成統一尺寸的擬胚體。Shi Meng等[33]采用Xu Feng等[32]的打印技術，設計了一款非接觸式玻璃化裝置。該裝置由細胞室、液氮室及中間的一層150 μm超薄高導熱速率銀膜構成。實驗時，先采用Xu Feng等[32]的細胞打印機，將氣動壓力設定為0.03 MPa，在細胞室形成一個8×8的均勻液滴矩陣。然后向液氮室注入液氮，利用液氮沸騰和超薄銀膜熱傳遞，即可迅速實現細胞玻璃化。該裝置已成功實現NIH3T3細胞和hASCs細胞玻璃化保存，且避免了液氮對細胞造成的潛在污染。噴墨打印是利用壓電元件驅動流體體積壓縮，儲液罐內壓力增加，導致細胞懸浮液通過噴嘴噴出微滴。U. Demirci等[34-35]基于噴墨打印技術開發出新型的生物打印裝置。裝置利用脈沖激勵時間控制微滴生成，產生的微滴均垂直滴入下方液氮中玻璃化。凍存細胞用直徑70 μm的細胞篩收集，并迅速轉移到解凍液中解凍。結果顯示，用類似于慢速冷凍所用的低濃度低溫保護劑，1.5 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖即可實現玻璃化，復溫后細胞存活率超過90%。目前，該方法已經成功應用于多種動物細胞類型的玻璃化保存，如鼠肝細胞、3T3成纖維細胞、HL-1心肌細胞、小鼠胚胎干細胞和淋巴母細胞[34]。R. Dou等[36]同樣采用噴墨打印技術，將含有小鼠成纖維細胞3T3和人類神經祖細胞的懸浮液，以9×9的矩陣形式打印在聚合物底板上，微滴體積約380皮升，然后轉移到溫度為293 K的冰箱內玻璃化。用DMSO作抗凍劑對3T3細胞進行玻璃化實驗，結果顯示解凍后細胞平均活性大于90%，所需的CPAs濃度小于0.8 mol/L。與其他玻璃化保存方法相比，所需的CPAs濃度明顯降低。對人類神經祖細胞進行玻璃化保存，復蘇后細胞活性僅55%，但與采用傳統方法所獲得的細胞存活率具有可比性，所需的CPAs濃度也明顯降低。

生物打印技術能迅速產生大小均勻的液滴，精準控制液滴噴射位置和方向，具有簡單性和敏捷性。然而在低溫保存領域，生物打印技術的應用仍存在挑戰，如生成微滴時，剪應力、毛細管力等機械力均可能引起細胞變形；將細胞打印到接收面時，接觸面對細胞的沖擊力易造成細胞損傷等。因此，采用生物打印微滴玻璃化保存時，還需進一步優化方案，如選擇合適的微滴產生機制、選擇具有生物相容性的噴頭及合理設計接收面等。

4 微流體封裝微滴玻璃化保存

微流體液滴生成技術是指將兩種不相融的流體，一種作為連續相，另一種作為分散相，將分散相以微小體積(10-15～10-9L)單元形式分散于連續相中，在表面張力與剪切力共同作用下，自發形成微滴[37]。微滴生成方式可分為被動法和主動法，被動法是通過控制微管道結構及兩相流速來控制微滴生成；主動法是通過外場驅動力，如熱量、氣壓、壓電、微閥和磁場等，來生成微滴[38]。目前微流體技術已成功應用于DNA、蛋白質、酶的生化分析及細胞的篩選、病毒檢測等多個領域，逐步拓展到玻璃化保存領域。

Huang Haishui等[39]設計了一款5個入口的微流體聚焦裝置，由此制備細胞微膠囊。通道中間入口注含有細胞的懸浮液，兩側注海藻酸水溶液，利用海藻酸水溶液將細胞限制在所生成的微膠囊內部。距聚焦口最近的兩側通氯化鈣溶液，運用瑞利-高原不穩定性，含有細胞的懸浮液被連續流動的氯化鈣溶液封裝成微滴。在該流動條件下，形成的微滴具有高分散性，微膠囊直徑約220 μm。研究表明，少量的鈣離子能增加藻酸鹽基質強度，有助于保持微膠囊玻璃化保存后的完整性[40]。采用該裝置封裝小鼠胚胎干細胞(mESCs)和人類脂肪干細胞(hADSCs)。于通道末端收集細胞微膠囊，然后用QMC法和OPS法玻璃化保存。結果表明，用1.5 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖作為低溫保護劑即可實現玻璃化，且復溫后細胞活性大于80%。通過低溫顯微鏡觀察，發現海藻酸鹽微膠囊能有效抑制復溫后反玻璃化現象發生。在采用微流體技術封裝細胞時，保證每個微滴中所含細胞數的均勻性是該技術的關鍵。M. Chabert等[41]設計了一種T型微流控裝置，該裝置運用純粹的動力學方法，在沒有任何外部傳感及反饋控制下，即可將細胞封裝成皮升級微滴。通道中間入口通含細胞的培養基，左右兩側通入油，以油作為連續相，在剪切流中可變形物體的橫向漂移和擠壓流中立體驅動分散作用下，每秒可對160個細胞進行連續封裝和排序。結果表明，封裝的微滴中僅含有一個細胞的純度為70%～80%，僅有1%的微滴可能為空液滴。J. F. Edd等[42]采用同樣的裝置對細胞進行封裝排序，并檢測細胞活性，92.9%的細胞膜保持完整性，對照組為96.2%。裝置每秒可產生14.9×103個皮升級液滴，明顯具有細胞封裝微滴體積小、通量高的特點。此外，在實現微流控芯片一體化方面，A. E. Sgro等[43]曾嘗試在微流體芯片上直接對B淋巴瘤細胞封裝冷凍。他提出在T型微通道的蛇形通道下游放置熱電制冷器，利用水溶液和不混溶油冰點差別大，通過熱電制冷器控制微流控芯片的部分溫度，直接凍結芯片上的微滴。該裝置在微流體芯片封裝微滴玻璃化保存一體化結構設計上具有啟發性。

微流體封裝液滴玻璃化保存具有細胞封裝效率高、微滴體積小的優點。然而，目前微流體封裝微滴玻璃化保存相關研究尚處于起步階段，仍面臨諸多挑戰，如封裝的微滴體積可達到皮升級，易造成細胞缺氧，針對此問題，一種包含空氣供應和多噴嘴出口的三維微流體裝置[44]正在研發中。在材質選擇上，微流體芯片選用具有疏水性的聚二甲基硅氧烷制作，但仍面臨導熱受限，無法在芯片上直接實現玻璃化的問題。

5 總結與展望

最小體積法玻璃化保存為細胞長期有效儲存提供重要手段。本文綜述了最小體積法玻璃化保存的最新研究進展，包括有載體的微滴玻璃化保存、噴射納升級微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存、微流體封裝微滴玻璃化保存。其中，新型的微滴生成技術，如噴射技術、生物打印技術、微流體封裝技術，可迅速產生大小均勻、尺寸微小的液滴。將其與玻璃化保存相結合，有望解決高通量問題，且滿足自動化要求，將是未來最小體積法玻璃化保存的發展趨勢。