羊腹腔鏡深部授精技術的應用*

崔北亮 ，石國慶 ，萬鵬程 ，倪建宏 ，劉長彬 *

（1.新疆生產建設兵團第九師一六一團畜牧獸醫工作站，新疆 裕民縣 834800；2.省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室/新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所）

腹腔鏡技術亦有人稱之為“鑰匙孔”技術，是一門新發展起來的微創方法，是人、畜未來手術方法發展的一個必然趨勢。隨著高精端工業制造技術的進步，多學科的交叉融合，為新方法、新技術奠定了堅實的基礎，加上技術人員的嫻熟操作，越來越多的開放性手術已被腹腔鏡技術取而代之，為微創手術增加了選擇機會。

人工授精技術最早在1780年由意大利生理學家L.Spallanzani在狗上獲得成功。俄國學者E.I.Ivanoff在1900年分別在馬、牛和綿羊上獲得成功。20世紀30年代開始，人工授精技術逐步成熟，開始由實驗室走向生產實踐。1936年丹麥成立了第一個人工授精協會。1938年美國成立了第一個人工授精合作會。20世紀40年代，人工授精技術在世界范圍內得到迅速的推廣和應用。畜牧業發達國家如美國、英國、加拿大和日本等國開始普及牛的人工授精技術，且具有非常大的應用規模。我國近30年來，無論在人工授精規模、品種和范圍上都取得了長足的發展。人工授精技術和冷凍精液的應用在中國荷斯坦奶牛的培育中起到了舉足輕重的作用。隨著我國舍飼畜牧業的大發展，在規模化養豬場、羊場、雞場和特種動物養殖場等地方人工授精技術顯得越來越迫切[1-3]。

腹腔鏡是用于腹腔內檢查和治療的內窺鏡，其實質上是一種纖維光源內窺鏡，包括腹腔鏡鏡頭、光源系統和光導纖維。運用腹腔鏡系統技術，可通過腹腔鏡鏡頭直接觀察到腹腔內的情況，施行精確操作，具有手術時間短、創口小、并發癥少、安全、恢復快等優點。近年來，腹腔鏡技術發展迅速，既可用于檢查，亦可用于治療，是目前世界上最先進、最尖端的微創技術，在治療外科疾病中的作用已受到越來越多人的矚目。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 冷凍精液來源

凍精采自白薩福克肉羊，自行通過卡蘇凍精設備生產。

1.1.2 受體羊

受體羊為2～5歲或生產過1胎、生殖系統健康及無傳染病的湖羊。

1.1.3 供試器材

擁有自主知識產權的羊胚胎移植架、子宮角輸精槍（德國）、腹腔鏡（Wolf，德國）、恒溫水浴鍋、打孔器、顯微鏡（國產）、CO2鋼瓶（國產）、持針鉗、縫合針及線、工作服、液氮罐、液氮、注射器（5 mL）、溫度計、碘酒及酒精、新吉爾滅消毒液、抽紙、耳標等主要實驗器材及耗材。

1.1.4 供試藥品

進口海綿栓、孕馬血清促性腺激素、青霉素等。

1.2 試驗方法

1.2.1 受體羊同期發情處理

受體羊同期發情采用陰道海綿栓處理法，將進口海綿栓通過海綿栓放置器放入母羊陰道深部，放置當天設為0 d，第11～13天撤除海綿栓，同時肌肉注射PMSG 250～330 IU，撤栓后24～48 h進行受體羊試情，并做好標記，記錄發情日期，受體羊斷食斷水，等待輸精。

1.2.2 凍精質量鑒定

將冷凍好的細管精液在水浴鍋內（37℃）放置10～30 s解凍，解凍后取出并及時將細管上的水珠擦拭干凈，剪去一端，將少量解凍好的精液推至載玻片上，并蓋上蓋玻片，放置在顯微鏡物鏡上，調整光源，觀察精子活力，精子活力在0.3以上即可用于輸精。

1.2.3 妊娠檢查

于胚胎移植后的45～60 d進行B超檢查，統計受胎率。

1.2.4 統計與分析

試驗數據采用卡方檢驗進行差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 湖羊同期發情率

湖羊是常年發情，且具有明顯的多胎優勢。本試驗采用進口海綿栓＋PMSG的處理技術，埋栓時長為11 d，在第11天肌肉注射PMSG 330 IU，取得較好的同期化發情效果（見表1）。

表1 試驗湖羊海綿栓+PMSG同期化發情效果

2.2 湖羊腹腔鏡輸精受胎率

表2 試驗湖羊腹腔鏡輸精情期受胎率

傳統的陰道輸精情期受胎率較低，一般在45%～55%之間，而腹腔鏡輸精大大提高了人工授精的受胎率，一般為70%左右，最高可達90%以上。本試驗采用腹腔鏡輸精技術共計2批次輸精118只湖羊，受胎率平均達到了90%以上（見表2）。

3 討論

3.1 不同同期化發情處理方法的同期效果

20世紀80年代，我國開始綿羊同期發情技術和推廣的研究應用。1980年，張儒學用MAP（甲孕酮）＋FSH（促卵泡生成素）＋LH（促黃體素）進行綿羊同期發情試驗研究，MAP用量為60mg，埋植時間為16 d，第16天撤栓同時肌肉注射FSH 30～35 IU，8 h后肌肉注射LH 15～22 IU，同期發情率100%，受胎率78%，產羔率142%。1983年，王茂采用PG（氯前列烯醇）＋ICT（三合激素）進行同期發情試驗研究，也取得了成功。1987年，林子忠等采用皮下埋植法，獲得80%的同期發情率。1989年，陳家振用孕激素＋PGF2a＋PMSG的處理方法，即孕酮肌肉注射7～9 d，再注射PGF2a和PMSG，獲得了86%的同期發情率。20世紀90年代以來，隨著綿羊同期發情技術的成熟，以及新藥品的層出不窮和研究的深入。目前，最常用的埋植方法有栓劑陰道埋植和皮下埋植，常用的緩釋產品有海綿栓、硅膠栓等[7-9]。另外，還有以黃體溶解達到發情的方法，主要是氯前列烯醇法[10-13]。

本試驗研究采用海綿栓＋PMSG和PG法進行對比，從數據可以看出，海綿栓＋PMSG的同期發情處理方法達到較高的同期發情率，差異顯著 （P＜0.05）。為了降低生產成本，增加生產效益，本試驗沒有注射LH激素，同樣取得了較為整齊和較高的同期率，可以在規模化羊場中推廣應用。

同期發情效果的成功與否直接影響輸精效果，主要體現在兩個方面，一是羊同期發情率不高，能夠達到輸精標準的不多；二是同期發情的目的就是達到發情整齊。如果羊發情不整齊，同一時間輸精后，就達不到預期的受胎效果。

3.2 腹腔鏡深部授精與傳統授精效果比較

腹腔鏡技術在動物中的應用主要集中在輔助人工授精。20世紀80年代Morcom等將腹腔鏡技術運用到豬的輸卵管人工授精上，之后有研究將腹腔鏡技術用在羊的人工授精上，并取得了成功，提高了母羊的情期受胎率。Fantinati P等報道，采用腹腔鏡技術授精，能夠減少輸精量，且不影響受胎率。隨著腹腔鏡技術的不斷發展，腹腔鏡技術的應用范圍越來越廣闊。Besenfelder U等在家兔上采用腹腔鏡技術初步進行了胚胎移植，移植過程方便、快捷，動物的手術應激反應明顯減少，還有人嘗試用腹腔鏡技術對家兔進行了取卵操作，該技術的成熟和應用為體外受精、轉基因研究等提供了方便[14-16]。

本試驗采用腹腔鏡深部輸精技術，與傳統的陰道輸精比較，腹腔鏡輸精能夠獲得較高的情期受胎率（90%以上），與傳統的輸精方式相比差異極顯著（P<0.01）。

腹腔鏡深部授精技術優勢明顯，主要體現在：一是減少了公羊試情；二是減少了觀察和抓羊的人力；三是減少了輸精時根據陰道粘液分泌物特性來判斷羊是否發情的麻煩；四是減少了人為判斷失誤的情況發生；五是與傳統的輸精方法相比，腹腔鏡授精具有明顯的優勢和較高的情期受胎率。

4 腹腔鏡技術應用前景

目前，腹腔鏡技術在畜牧業中的應用相對滯后，主要集中在羊的人工授精、胚胎移植、卵巢表面活動規律變化觀察等方面，究其原因可能與畜牧技術員對腹腔鏡的作用認識不夠和不全有關，以及設備費用較貴等原因導致。隨著科研投入的不斷加大，技術人員對腹腔鏡技術的熟練掌握，腹腔鏡技術以其獨有的創傷小、恢復快、刺激性小等優勢，在羊人工授精、胚胎移植和卵巢活動觀察等手術中一定會突顯出來，其必定會被廣泛應用于獸醫臨床診療、動物繁殖育種及生物工程等生命科學領域。