透射電子顯微鏡在生物大分子結構與功能研究中的應用

梁昂昂

摘 要：透射電子顯微鏡的基本原理和主要的兩種樣品制備方法，冷凍電鏡技術和負染色技術。

關鍵詞：TEM ，CRYO-EM ，NS-EM

1932年德國科學家Ruska研制出以電子束作為光源的透射電子顯微鏡，得益于電子顯微鏡遠高于光學顯微鏡的分辨能力，人類第一次看到細胞及其內部器官的細節，病毒的結構。隨著對生物體微觀結構的探索，電子顯微鏡也隨之顯示出巨大的潛力。

迄今為止，電子顯微鏡獲得的三維信息仍然依賴于物體的透射二維圖像，即通過得到大量從不同角度獲取的投影，從而重建物體的三維結構信息。

（一）透射電子顯微鏡成像原理

簡單地說，透射電子顯微鏡是以電子束作為照明光源的顯微鏡，其實質是通過外部電磁場作用使電子束產生彎曲，從而形成電子束“透鏡”。由于經過高電壓加速的電子波長很短，所以電子顯微鏡的分辨率要大大高于傳統的光學顯微鏡。事實上，現代電子顯微鏡的分辨率已經達到了1？的水平（但是相較于電子的波長，電子顯微鏡的分辨本領仍然有很大的潛力）。

一般來說，透射電子顯微鏡的工作原理是：由電子槍發射出電子束，經過被抽成高真空狀態的鏡腔通道中，沿光軸方向通過聚光鏡，然后電子束會聚成一束很細且亮度均勻的光斑，照射在放置于樣品室內的樣品上；入射電子與樣品會發生各種各樣的相互作用，除了直接透過的電子，其他電子將會和樣品內部原子發生相互作用而被散射，因為不同的原子和不同的作用距離會影響電子的空間出射角度，因此透過樣品后的電子束將攜帶樣品內部的結構信息；然后通過物鏡的會聚調焦，且應用光闌把將彈性散射電子阻擋后，電子束被初級放大，然后進入下級中間透鏡并和投影鏡系統進行進一步的放大成像，最后將被放大了的電子影像投射在觀察室內的熒光屏上，供使用者觀察，并可被CCD記錄。

在電子顯微鏡成像過程中，由于電子顯微鏡中各器件的影響，從傅立葉空間中看，樣品的振幅和相位信息將被電子顯微鏡調制，從而在成像過程中附加儀器信息。這些額外的信息可以通過所謂的襯度傳遞函數（CTF）來表示，其主要參數包括電鏡的球差系數，電子的波長，欠焦值和頻率值等，其形狀類似隨頻率而變化的正弦波。再加上由于電子束干涉質量、能量擴散、色差、電流和電壓不穩定引起的頻率衰減效應，導致頻譜空間將有一個類似衰減正弦波的調制函數，該調制函數與物體的頻率信號疊加后，就是最終的物象信息。

當然，作為一種探測儀器，儀器的狀態當然非常重要，但更重要的是能夠制備出厚度較為適宜且品性良好的生物大分子電鏡材料樣品。

（二）生物大分子電鏡樣品的制備方法

為了保證電子顯微鏡中電子光路的穩定性并消除由空氣引起的電子散射，電子顯微鏡內部都是高真空環境。理想情況下，生物大分子需要存在于完全適應本體真實生活環境的溶液中。這就產生了一個矛盾：電子顯微鏡的高真空與生物樣品的自然生存環境之間的矛盾。為了解決這一問題，必須開發特殊的生物樣品制備方法和合適的樣品載體以及相應的電子顯微鏡裝置。下面簡要介紹兩種當前最主要的生物大分子電鏡樣品的制備方法：冷凍電鏡法和負染色法。

1）冷凍電鏡技術（cryo-electronmicroscopy）

冷凍電子顯微鏡，簡稱冷凍電鏡，是指將生物大分子快速冷凍后，在低溫下用透射電子顯微鏡對樣品進行成像，并通過圖像處理和重構計算得到樣品的三維結構。單顆粒低溫電子顯微鏡技術可以觀察到少量的非晶態生物樣品，獲得高分辨率的圖像，因此，冷凍電鏡技術已成為研究生物大分子結構的重要手段。

冷凍電鏡樣品制備的基本流程是將載有樣品的電子顯微鏡網格快速投入冷卻的液態乙烷中，在載網孔或支持膜中形成玻璃態的冰，樣品顆粒（ 粒徑大約十幾到過百納米）分布在其中，形成冷凍樣品。玻璃體生物樣品可進一步制備成超薄切片，在冷凍電鏡下可觀察到近乎活體的超微結構。高壓冷凍樣品制備技術避免了樣品中可溶性成分的提取、丟失和移位，使研究人員能夠直接觀察到接近生存狀態的細胞和組織的自然形態。

電子束輻照引起的損傷取決于電子劑量、樣品的溫度和電子束的能量。生物樣品的性質決定了必須采用低劑量電子成像技術。對超低溫樣品的觀察，不僅解決了樣品中水分含量的問題，而且減少了電子輻照和溫度提升對生物樣品的損傷。然而，這種低劑量成像的最大問題是單張電子顯微鏡圖像的信噪比較低，照片襯度低，由此導致圖像模糊。因此，新的成像設備和強大的圖像處理系統對冷凍電鏡的發展至關重要。2012-2013年，電子直接檢測相機（ electrondirect detection device，DDD）的應用使冷凍電鏡突破了技術難關。DDD相機能直接探測高能電子，使信噪比和空間分辨率大大提升。

2）負染色電鏡技術（NS EM）

負染色法最早由Brenner和Horne在1959提出。作為一種傳統的制備電鏡樣品的方法，負染色技術因其簡單、快捷、成像襯度高等優點而得到廣泛應用。這種方法主要用染色劑中的重金屬粒子沉積在大分子周圍，使大分子被包埋起來，這相當于重金屬層形成一個中空的大分子輪廓（由于重金屬的分子量較大，大分子物質將近似為空白物），由于重金屬粒子的滲入效應，有時甚至可以顯示出大分子的內部結構。

一般生物樣品負染操作的流程是：將濃度符合要求的樣品溶液滴在經輝光放電處理后的載物片上，并保持一段時間（約1分鐘）；然后將多余的溶液除去，然后迅速滴上染色劑，并使染色劑與生物樣品顆粒充分接觸（反應數十秒至數分鐘），把多余的染色劑吸除后干燥即可。

現如今，雖然冷凍電鏡被廣泛使用，負染色技術仍然被廣泛應用于高分辨率電子顯微鏡的結構研究中。事實上，冷凍三維結構研究的最初階段大多要先經過負染電鏡研究，有時研究時長長達數年。

（三）基于透射電鏡的生物大分子三維結構重構

僅憑借生物大分子的氨基酸序列并不能夠完全揭示大分子的功能原因。事實上，正是這些氨基酸序列的三維結構決定了生物大分子的功能狀態。因此，如果要研究生物大分子的功能，就必須了解它的結構。在此基礎上，隨著計算生物學的迅速發展，X射線晶體學、核磁共振（NMR）和電鏡技術已成為當今生物結構檢測的主要手段。

然而，X射線晶體學需要多維結晶的樣品，核磁共振則需要樣品有序，且對樣品分子量有一定限制。電鏡方法則可以不需結晶，并對分子量沒有限制，而且還可以采用瞬時冷凍的方法保持生物大分子的天然活性，甚至可以單獨觀察并重構任意一個大分子的三維結構，從而顯示出其獨特的優勢。

參考文獻：

胰蛋白結構與功能的透射電子顯微鏡研究 張磊

冷凍電鏡技術：從原子尺度看生命 楊慧，李慎濤，薛冰

冷凍電鏡單顆粒技術解析生物大分子結構綜述 張世超，歐陽燕，劉善輝，朱莉