臍血造血干細胞分離方法的實驗研究

王永娟

摘 要：臍血作為一種造血干細胞來源可替代骨髓進行造血干細胞移植， 臍血移植在治療兒童遺傳性疾病和血液病方面取得了巨大的成效。為進一步推廣臍血移植，必須相應地建立起完備的臍血庫。臍血庫不同于骨髓庫， 它必須凍存實物。為減少凍存體積， 降低成本， 需要采取有效的方法分離臍血中有核細胞， 從而使大規模、廣泛地建立臍血庫成為可能。本文對臍血造血干細胞分離進行實驗研究分析。

引言

臍帶血（umbilical cord blood，UCB） 是產后留存在胎盤和臍帶中的血液， 以往被作為醫學廢物而丟棄。近十幾年的研究發現，人臍帶中存在大量間充質干細胞，間充質干細胞（mesenchymal sterncells，MSCs）是成體干細胞的一種，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能， 可以重建人體造血和免疫系統的造血干/祖細胞， 可用于造血干細胞移植，治療多種疾病。

一、試驗方法

1.1臍帶血造血干細胞分離

利用離心沉降法和自然沉降法分離臍帶血有核細胞，計算有核細胞回收率和紅細胞回收率，比較兩種分離方法的分離效果。

離心沉降法：將6%的羥乙基淀粉注射液和臍帶血按照1∶5的比例混合，慢速搖勻10min，以50g、10℃離心7min，收集上層富白細胞血漿，再以400g、10℃離心15min，去除血漿。

自然沉降法：將6%的羥乙基淀粉注射液和臍帶血按照1：5的比例混合，慢速搖勻10min，懸掛讓其內細胞自然沉降1h后，收集上層富白細胞血漿，同樣以400g、10℃離心15min，去除血漿。

1.2臍帶血造血干細胞凍存

將分離后的臍帶血分別與4種不同的冷凍保護劑混合，臍帶血與冷凍保護劑的體積比為4∶1，混合時應將冷凍保護劑緩慢注入臍帶血中，邊注入邊晃動。用程控降溫儀按以下程序降溫，4℃保持10min，以-1℃/min的速率降溫至-40℃，再以-10℃/min的速率降溫至-80℃，完成后將臍帶血混合物放入液氮罐中儲存。4種冷凍保護劑分別為：DMSO和0.9%氯化鈉溶液1∶1混合液，DMSO和6%右旋糖酐1∶1混合液，DMSO和6%羥乙基淀粉1∶1混合液，DMSO、胎牛血清和F12培養基9∶4∶5混合液。冷凍保護劑新鮮配制并于4℃提前預冷。

1.3凍存后復蘇

臍帶血凍存3個月后，將凍存的臍帶血在37℃水浴鍋中復蘇，測細胞存活率，用流式細胞儀進行造血干細胞表面標志等分析，并進行祖細胞集落培養，從而比較4種冷凍保護劑的凍存效果的差異性。

1.4存活率檢測

取100μL臍帶血樣品，加入900μL氯化銨溶血素，4℃避光反應5min，200g離心5min，棄上清加入細胞重懸液900μL重懸，再取50μL混合液加入臺盼藍2X溶液50μL，靜置3min后計數。每個樣品至少數300個細胞，計算有核細胞存活率。

1.5流式細胞儀檢測

計數CD34+細胞是檢驗造血干細胞活性的公認方法之一。取50μL臍帶血樣品，加入小鼠抗人CD34-PE、CD45-FITC抗體各10μL，室溫避光孵育20min，然后加入300μL溶血素避光反應15min，最后加入300μL鞘液避光靜置3min，待流式細胞儀檢測。

1.6祖細胞集落培養

集落形成分析是一種檢驗造血干祖細胞活性公認的敏感方法。取100μL臍帶血樣品，加入900μL氯化銨溶血素，4℃避光反應5min，200g離心5min，棄上清后加入1mLIMDM洗滌2次，加入200μLIMDM重懸，取適量細胞加入甲基纖維素培養基中，培養基中細胞終濃度1×105cells/mL，混勻培養基后平分為2份加入到24孔培養板中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養12d后分別對CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E進行計數統計。

1.7凍存時間對臍帶血造血干細胞的影響

選擇上述研究中最佳冷凍保護劑，采用相同的試劑和方法，比較同一份臍帶血樣本凍存前、凍存3個月、6個月和一年的存活率、有核細胞數、CD34+造血干細胞數、祖細胞集落數。

1.8統計方法

采用SPSS19.0軟件進行數據分析，測定結果均按平均值±標準差表示，統計學處理采用區組設計的方差分析，顯著性水平為P<0.05。

二、試驗結果

2.1有核細胞分離效果

離心沉降法有核細胞回收率為83.60%±9.44%，自然沉降法有核細胞回收率為86.40%±8.49%，二者之間差異無顯著性意義（P>0.05），但離心沉降法所需時間更短，操作簡便，更適合臍帶血庫。

2.2復蘇后有核細胞回收率和存活率

4種凍存液凍存的細胞復蘇后有核細胞回收率和存活率結果見表1。結果表明：第4種冷凍保護劑凍存的細胞復蘇后有核細胞回收率與前3種的差異有極顯著意義（P<0.01），且數據偏低不能達到要求；第1，2，3種冷凍保護劑復蘇有核細胞回收率的差異無顯著意義（P>0.05）；4種冷凍保護劑復蘇細胞存活率的差異有極顯著意義（P<0.01），其中第2種和第3種差異不顯著，復蘇后存活率最佳。

2.3復蘇后流式分析和祖細胞培養

4種冷凍保護劑凍存的細胞復蘇流式分析和祖細胞培養結果見表2。4種冷凍保護劑冷凍的細胞復蘇CD34+回收率和祖細胞回收率的差異均有極顯著意義（P<0.01），其中第2種和第3種差異不顯著，流式CD34+和祖細胞回收率最高。

三、結果與討論

分離臍帶血造血干細胞方法常采用分選法、羥乙基淀粉沉淀法和密度梯度離心法。由于目的不同，各類方法有其自身特點。分選法使用磁珠或流式細胞配合相應單克隆抗體分離得到較純的細胞群體，但細胞回收率較低，且成本昂貴，適合對細胞純度要求較高的研究； 密度梯度離心法多采用Percoll、Ficoll 分離液分離細胞，得到單個核細胞群，但純度不高； 羥乙基淀粉沉淀法，分離的細胞量大、成分較多但紅細胞含量高，適合臍帶血庫等用于大量分離儲存干細胞。本研究對臍帶血庫常用的羥乙基淀粉自然沉降法和離心沉降法的有核細胞回收率進行了比較，結果顯示兩種方法差異無統計學意義，離心沉降法效率更高。

參考文獻：

[1]劉獻志，劉紫輝，楊波.臍血造血干細胞分離方法的實驗研究[J].醫藥論壇雜志，2007（05）：52-54.