新疆葡萄酒中赭曲霉毒素A含 量分析

全 莉，馬文瑞，王雪薇，王舸楠，蒲秋蓮，宋 鈺，武 運*，薛 潔

（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國食品發酵工業研究院有限公司酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京 100015；3.吐魯番市質量與計量檢測所，新疆 吐魯番 838000）

赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產生的有毒代謝產物，包括A、B、C、D（α）四種化學結構非常相似的化合物，其中，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）在自然界中最常見、毒性最強，對人類和動物的健康威脅最大[1]。OTA在許多食品和飲料（如葡萄酒和葡萄汁）中普遍存在[2]，OTA對多種動物具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性[3]，被國際癌癥研究機構（international agency for research on cancer，IARC）定為2B類致癌物[4]。OTA易溶于極性有機溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水；OTA具有熱穩定性，加工過程只能去除一小部分的OTA，甚至在250℃高溫條件下都不能完全降解[5]。1995年，ZIMMERLI B等[6]首次在葡萄酒和葡萄汁中發現含有OTA，目前OTA已被認為是葡萄及其深加工產品中主要真菌毒素[7]。

鑒于OTA的潛在危害，2002年歐盟對人們日常飲食中攝取的OTA情況進行了調查，調查結果發現除谷物及谷物產品外，葡萄酒是人們攝取OTA的主要來源[8]，因此2005年1月1日歐盟規定了葡萄酒以及用于飲料制作的葡萄汁中OTA的限量標準為2.0 μg/L[9]；國際葡萄與葡萄酒組織（international vine and wine organization，OIV）也推薦葡萄酒中OTA的最大限量為2.0 μg/L[10]。我國于2017年3月17日發布的國標GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中同樣對赭曲毒素（OTA）做出規定，該規定限制葡萄酒中OTA含量低于2 μg/L并于2017年9月17日生效，可見葡萄酒質量控制尤其是葡萄酒OTA含量的控制已經成為亟待解決的問題[11]。

研究表明，葡萄酒中的OTA問題主要與葡萄原料是否感染真菌病害有關，OTA含量的高低取決于葡萄酒的類型、原產地以及采收時間[12]。一般來講。由于釀酒工藝的差異，紅葡萄酒中OTA含量顯著高于白葡萄酒和桃紅葡萄酒[13]。釀酒葡萄產區緯度越低，葡萄酒中的OTA含量也相對比較高，這主要由于氣候、葡萄栽培方式和貯存條件不同所致[14]。目前葡萄酒中OTA檢測主要有高效液相法（high performanceliquidchromatography，HPLC）和酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[15]。HPLC法所用儀器昂貴、對樣品的預處理步驟復雜、檢測成本高、耗時長。ELISA法因具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、適于大批量樣品檢測的特點被采用。新疆是中國釀酒葡萄十大產區之一，具有種植優質釀酒葡萄得天獨厚的地理資源優勢，自古以來就是中國主要的釀酒葡萄及葡萄酒產地，而作為西部產區，目前有關新疆葡萄酒中OTA含量的研究還比較少，生產過程中又缺乏嚴格的產品質量保證措施，產品質量安全有待提升，因此跟蹤生產中潛在安全影響因素是保證新疆葡萄酒質量安全的控制要素。本研究建立了分析OTA的快速檢測方法，并對新疆葡萄酒中的OTA含量現狀進行了調查分析，跟蹤了生產過程中OTA含量的變化規律，以期為提升新疆葡萄酒質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品（32種）：來自新疆天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地和吐哈盆地四大產區酒莊的葡萄原酒；甲醇（色譜純）、OTA液體標準品（純度99%）：上海安普試驗科技股份有限公司；2-16N高速微量離心機：湖南恒諾儀器設備有限公司；鹽酸、氯化鈉（均為分析純）：北京化工廠；AgraQuant赭曲霉毒素A酶聯免疫試劑盒：北京集束科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平：梅特勒-托利多公司；Multiskan FC酶標儀：上海天能科技有限公司；VORTEX-S渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C雷磁pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標液的制備

準確移取10 mg/L OTA標準液1 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到100 μg/L的OTA儲備液，置于-20℃避光保存。

1.3.2 AgraQuant赭曲霉毒素A酶聯免疫試劑盒檢測方法

準確移取3 mL葡萄酒樣品至一個檢測試管中，加入5.7 mL無水甲醇，渦旋振蕩30 s，用1 mol/L NaOH或HCl將pH值調至6.5～7.5。吸取200 μL酶聯偶合物至稀釋孔，加入100μL標準品或樣品提取液至稀釋孔，充分混合后移取100μL至有抗體包被的微孔里，室溫條件下放置10 min，用去離子水清洗5次，拍干微孔板，吸取100 μL底物至每個微孔中，室溫條件下放置5 min，吸取100 μL終止液至每個微孔板，用酶標儀在波長450 nm濾鏡及波長630 nm示差濾鏡下讀取結果。

1.3.3 新疆葡萄酒中OTA的含量分析

（1）新疆葡萄酒中OTA含量的分析

考察了32種新疆葡萄酒樣品（白葡萄酒14種，紅葡萄酒18種）中OTA含量。

（2）新疆四大產區紅葡萄酒和白葡萄酒中OTA含量分析考察了新疆四大產區（焉耆盆地、吐哈盆地、伊犁河谷、天山北麓）葡萄酒中OTA含量。

（3）葡萄酒釀造過程中OTA含量的變化研究

對新疆某葡萄酒企業工業化釀造期間（白葡萄：霞多麗；紅葡萄：美樂）葡萄酒中OTA進行全方位的跟蹤測定，研究OTA在葡萄酒釀造各個過程中的變化情況。

2 結果與分析

2.1 方法有效性的驗證

2.1.1 標準曲線的制作

配制OTA標準液質量濃度分別為0、2 μg/L、5 μg/L、20 μg/L和40 μg/L，按上述試驗條件處理，以質量濃度的對數值（lg Conc.）為橫坐標，吸光度值差值的對數值（B為吸光度值，Bo為零點吸光度值）為縱坐標繪制OTA標準曲線，結果見圖1。

圖1 酶聯免疫法法檢測OTA標準曲線Fig.1 Standard curve of OTA analysis by enzyme-linked immunoassay

由圖1可知，OTA在0～40 μg/L范圍內線性關系良好，回歸方程為y=-1.243 5x+0.918 8，R2=0.998 9。

2.1.2 精密度試驗

在5份3 mL空白葡萄酒樣品中，分別添加100 μg/L的OTA標品儲備液60μL，使葡萄酒樣品中OTA含量為2μg/L，重復測定5次，結果見表1。由表1可知，試驗結果的相對標準差（relative standard deviation，RSD）為3.54%，表明該方法精密度良好。

表1 OTA檢測精密度試驗結果Table 1 Results of precision tests for OTA determination

2.1.3 重復性試驗

在2份3mL空白葡萄酒樣品中，分別添加30μL、60μL、150 μL 100 μg/L的OTA標品儲備液，使葡萄酒樣品中OTA含量為1μg/L、2μg/L、5μg/L，在兩個不同的日期進行測定，比較差異，以評價方法的穩定性，結果見表2。

表2 OTA檢測重現性試驗結果Table 2 Results of repeatability tests for OTA determination

由表2可知，重現性試驗結果的相對標準偏差為4.34%，表明該方法重現性良好。

2.1.4 加標回收率試驗

在5份3mL空白葡萄酒樣品中，分別添加30μL、60μL、120μL、180μL、240μL100μg/L的OTA標品儲備液，使葡萄酒樣品中OTA含量為1 μg/L、2 μg/L、4 μg/L、6 μg/L、8 μg/L，每個水平作5次平行試驗，計算平均回收率和相對標準偏差。

表3 OTA檢測加標回收率試驗結果Table 3 Results of adding standard recovery rates for OTA determination

由表3可知，添加標品范圍為1～8 μg/L時，平均回收率為97.07%～111.00%，RSD均＜10%，說明該方法的準確度符合要求。

2.2 新疆葡萄酒中OTA含量的分析

2.2.1 新疆葡萄酒中OTA含量的分析

圖2 新疆葡萄酒中OTA檢出樣品含量分析Fig.2 Analysis of OTA content in Xinjiang wine

32種葡萄酒樣品中，18種樣品（56.25%）檢出OTA，14種樣品（43.75%）未檢出OTA。檢出OTA的樣品中OTA含量分析結果如圖2所示。

由圖2可知，檢出OTA的葡萄酒有9種樣品的OTA含量在0～0.5 μg/L；6種樣品的OTA含量在0.5～1.0 μg/L；3種樣品的OTA含量在1.0～1.5μg/L；所有樣品的OTA含量均未超過GB2761—2017《食品中真菌毒素限量》規定的2μg/L，說明新疆地區葡萄酒中的OTA是符合國家標準的。

2.2.2 新疆四大產區紅葡萄酒和白葡萄酒中OTA含量分析

考察了新疆四大產區白葡萄酒與紅葡萄酒中OTA的平均含量，結果如圖3所示。

圖3 不同產區紅葡萄酒和白葡萄酒中OTA含量分析Fig.3 Analysis of OTA content in red and white wines from different producing areas

由圖3可知，檢測到OTA的樣品中，紅葡萄酒有12種，白葡萄酒有6種，且紅葡萄酒中的OTA含量顯著高于白葡萄酒，這主要是由于紅葡萄酒是帶皮發酵，而白葡萄酒是清汁發酵，葡萄生長期間感染霉菌產生的OTA均在葡萄皮中，因此發酵前的清洗工藝有助于降低葡萄酒中的OTA含量。

其次，產區不同，葡萄酒中的OTA含量也不同，本研究中焉耆盆地和吐哈盆地產區葡萄酒中OTA檢出量較低，平均含量分別為0.19μg/L、0.20μg/L，而伊犁河谷和天山北麓產區葡萄酒中OTA檢出量較高，平均含量分別為0.46μg/L、0.60μg/L，根據資料報道，焉耆盆地和吐哈盆地的年平均降雨量不足100 mm[16]，這也說明了葡萄產區的氣候條件與OTA污染密切相關。

2.3 葡萄酒釀造過程中OTA含量的變化研究

對新疆某葡萄酒企業工業化釀造期間葡萄酒中OTA進行全方位的跟蹤測定，研究OTA在葡萄酒釀造各個過程中的變化情況，測定結果如圖4所示。

由圖4A可知，白葡萄酒釀造過程中，OTA含量呈顯著的下降趨勢，從初始的0.047 6 μg/L下降至發酵結束前的0.001 4 μg/L，下降了97.06%，其中下降幅度最大的是發酵前葡萄汁的澄清過程，下降了51.68%，而發酵前葡萄汁整個處理過程OTA含量的下降了89.08%，因此說明了澄清劑對控制葡萄酒中的OTA含量至關重要。

圖4 白（A）、紅（B）葡萄酒生產過程中OTA含量的變化情況Fig.4 Variation of OTA content in red(A)and white(B)wines during production process

由圖4B可知，紅葡萄酒釀造過程中OTA含量的變化規律不同于白葡萄酒，呈先升高后降低的趨勢，在葡萄酒滿罐循環后至加酵母前，由于葡萄皮渣與葡萄汁充分接觸，為了浸提單寧、色素和其他風味物質，OTA也隨之浸提到發酵葡萄汁中，從而導致發酵醪液中較高的OTA含量[17]。紅葡萄酒釀造過程中OTA含量從初始的0.022 μg/L增加至加酵母前的0.097 μg/L，增加了104.5%。而添加酵母后，葡萄酒中OTA含量呈現下降趨勢，主要原因有兩點：一是酵母的降解作用[18]；其次是由于酵母細胞壁的負電荷的吸附機制，以及OTA的酸性特點[19]，隨后在澄清過程被去掉。

3 討論

近年來，國內外對OTA的研究越來越多，酶聯免疫法（ELISA）已成為小麥、玉米等谷物OTA含量檢測的常用方法，時瑾等[20]采用ELISA方法檢測小麥樣品中的OTA，方法回收率為95%～110%，方法重現性良好，變異系數小于10%。本試驗回收率為97.07%～111.00%，RSD＜10%，說明采用ELISA方法檢測OTA對葡萄酒進行測定，該方法能夠達到GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中方法的檢測限，并且該方法有準確、簡便、無復雜的前處理的優點。試驗發現紅葡萄酒中OTA含量高于白葡萄酒，與康健對葡萄酒中赭曲霉毒素的研究一致[21]，這可能和葡萄酒的釀造工藝有關。GAMBUTI A等[22]研究了葡萄酒釀造工藝對葡萄酒中OTA含量的影響，研究認為澄清和過濾可以降低其含量；FERNANDES A等[23]的研究顯示，在浸漬過程中OTA的含量開始升高，在液固分離時，OTA大部分隨皮渣流失。本試驗結果與GAMBUTI A等[22]的研究結果一致，葡萄酒釀造浸漬過程中OTA含量會有所升高，但大部分OTA會隨著皮渣被除去，最終葡萄酒中OTA含量很低。原因可能是在發酵過程中，OTA結合在葡萄蛋白質和酵母細胞壁上，因此去除皮渣時，絕大多數OTA可以隨著皮渣被除去。

4 結論

建立了試驗室酶聯免疫快速檢測飲料酒中OTA含量的方法，該方法的精密度試驗結果RSD為3.54%，回收率為97.07%～111.00%，精密度及準確度符合要求。該方法可以滿足OTA的定量分析。

本試驗所檢測的32種葡萄酒樣品中，18種樣品（56.25%）檢出OTA，14種樣品（43.75%）未檢出OTA，所有樣品的OTA含量均未超過國標2 μg/L，說明新疆地區葡萄酒中OTA含量是符合國家標準的。

天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地和吐哈盆地四個產區的葡萄酒中OTA含量存在差異性，大多數紅葡萄酒中OTA含量高于白葡萄酒，焉耆盆地和吐哈盆地葡萄酒OTA含量（平均含量為0.19 μg/L、0.20 μg/L）低于天山北麓和伊犁河谷（平均含量為0.46 μg/L、0.60 μg/L），而焉耆盆地和吐哈盆地又是溫度較高降雨量較少的產區，這也說明了葡萄產區和葡萄產區的氣候條件與OTA污染密切相關。

白葡萄酒釀造過程中，OTA含量呈顯著的下降趨勢，下降幅度最大的是發酵前葡萄汁的澄清過程。然而紅葡萄酒釀造過程中OTA含量的變化規律不同于白葡萄酒，呈先升高后降低的趨勢，在葡萄酒滿罐循環后至加酵母前這個期間，為了浸提單寧、色素和其他風味物質，葡萄皮渣中的OTA也隨之浸提到發酵葡萄汁中，而添加酵母后，OTA又呈下降趨勢。