超高壓提取玫瑰花色苷及穩定性研究

張唯，嚴成*，張曦，金葉青，段旻燕，吳映川

(1.西南科技大學 生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.麗江程海沁香玫瑰莊園有限公司，云南 麗江 674100；3.麗江永勝森源食品有限公司，云南 麗江 674200)

玫瑰(RosarugosaThunb)，是薔薇科薔薇屬植物，是重要的香料植物[1]。我國的玫瑰資源大部分利用于天然香料玫瑰精油的提取上，然而玫瑰花中的花青素、多糖、黃酮類等物質是值得去探索研究的[2-8]。花色苷是廣泛存在于植物中的一種活性成分，是一種功能性著色劑，具有改善視覺、抗肥胖癥、抗糖尿病、抗癌癥、抗心血管疾病等生理功效[9-13]。玫瑰花色苷顏色艷麗、香氣馥郁，且含有生理功效，玫瑰花色苷的綜合開發利用具有廣闊的應用價值。

常用的花色苷提取方法包括有機溶劑提取法[14-16]、酶提取法[17,18]、微波輔助提取法[19,20]、超聲波輔助提取法[21,22]、高壓脈沖電場法等[23,24]。超高壓輔助提取法[25]，因其有效成分提取率高，且保留其生理活性，降低能耗，工藝操作簡單且安全等特點[26]，廣泛應用于中藥材的提取。

本試驗采用超高壓法提取玫瑰花色苷，以檸檬酸濃度、壓力、保壓時間、料液比為主要因素，通過響應面法優化提取工藝；同時探討了各因素對玫瑰花色苷的穩定性影響，旨在為玫瑰花色苷的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

法國墨紅玫瑰：麗江程海沁香玫瑰莊園有限公司；檸檬酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉、過氧化氫、氯化鉀、硝酸鋁、亞硫酸鈉：均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱 鞏義市瑞力儀器設備有限公司；高速粉碎機 陜西盛安醫療器械有限公司；UV1901型紫外可見分光光度計 四川億科實驗設備有限公司；便攜式pH計 上海平軒科學儀器有限公司；臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-2恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；HPP.L2-800/1型食品超高壓設備 天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司；DZ-280/2SD小型多功能真空封裝機 溫州卓越機電源頭廠家。

1.3 試驗方法

1.3.1 玫瑰花預處理

玫瑰花經挑選除雜，粉碎過80目篩，得玫瑰花干粉。

1.3.2 玫瑰花色苷提取工藝流程

玫瑰花粉→稱重(1.00 g)→提取劑溶解→超高壓提取→離心→取上清液→稀釋→測定吸光值。

1.3.3 玫瑰花色苷含量的測定

采用消光系數法測定玫瑰花色苷含量[27]。將離心得到的花色苷粗提液，在紫外分光光度計300～700 nm范圍內掃描，確定玫瑰花色苷的最大吸收波長。根據下列計算玫瑰花色苷提取量：

花色苷提取量(mg/100 g)=[(A×V)/(98.2×M)]×100。

式中：A為吸光值；V為定容體積(mL)×稀釋倍數；M為樣品重量(g)；98.2為花色苷平均消光系數。

1.3.4 單因素試驗

分別以不同的提取劑濃度、壓力、保壓時間和料液比為單因素，以玫瑰花色苷提取量為指標，考察各因素對玫瑰花色苷提取量的影響。

1.3.4.1 提取劑濃度對花色苷提取量的影響

在壓力為200 MPa、保壓時間為9 min、料液比為1∶25(g/mL)的條件下，檸檬酸濃度分別為0.5%，1%，5%，10%，15%，20%時，考察提取劑濃度對花色苷提取量的影響。

1.3.4.2 壓力對花色苷提取量的影響

在檸檬酸濃度為5%、保壓時間為9 min、液料比為1∶25(g/mL)的條件下，壓力分別為50，100，200，300，400，500 MPa時，考察壓力對花色苷提取量的影響。

1.3.4.3 保壓時間對花色苷提取量的影響

在檸檬酸濃度為5%、壓力為200 MPa、料液比為1∶25(g/mL)的條件下，保壓時間分別為3，6，9，12，15，18 min時，考察保壓時間對花色苷提取量的影響。

1.3.4.4 料液比對花色苷提取量的影響

在檸檬酸濃度為5%、壓力為200 MPa、保壓時間為9 min時，料液比分別為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(g/mL)時，考察料液比對花色苷提取量的影響。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，建立Box-Behnken 中心組合試驗，見表 1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Response surface experimental design

1.3.6 玫瑰花色苷穩定性試驗

1.3.6.1 pH對玫瑰花色苷穩定性的影響

將提取液稀釋適宜倍數后，加入鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液制成pH 1.0～8.0的花色苷溶液，待溶液顏色穩定后，測定其吸光值。

1.3.6.2 溫度對玫瑰花色苷穩定性的影響

將稀釋相同倍數的花色苷溶液，分別置于20，40，60，80，100 ℃水浴鍋中，每隔1 h測定其吸光值。

1.3.6.3 常見金屬離子對玫瑰花色苷穩定性的影響

配制離子濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的Na+，K+，Ca2+，Cu2+，Zn2+，Fe2+，Mg2+，Al3+，Fe3+的花色苷溶液，室內避光靜置，每隔1 h測定其吸光值。

1.3.6.4 氧化劑和還原劑對玫瑰花色苷穩定性的影響

分別配制質量分數為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的亞硫酸鈉的花色苷溶液和體積分數為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1%的過氧化氫的花色苷溶液，以不加亞硫酸鈉和過氧化氫的花色苷溶液做對照，室溫避光靜置，每隔1 h測定其吸光值。

1.3.7 數據處理

試驗數據用軟件Origin 8.5和Design-Expert 8.0.6.1進行分析。

2 結果與分析

2.1 玫瑰花色苷的最大吸收波長

圖1 玫瑰花色苷溶液最大吸收光譜圖Fig.1 The maximum absorption spectrum of rose anthocyanins solution

玫瑰花色苷提取液在300～700 nm的吸收光譜圖見圖1，在514 nm波長處有最大吸收峰。因此，選用 514 nm為玫瑰花色苷的最大吸收波長。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取劑濃度對玫瑰花色苷提取量的影響

圖2 檸檬酸濃度對花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on anthocyanins extraction

由圖2可知，在提取過程中檸檬酸濃度對花色苷提取量影響較大，隨著檸檬酸濃度的增大花色苷提取量呈現先增加后緩慢降低的趨勢。檸檬酸濃度達到10%時，花色苷pH值為1.58，提取量達到最高值，為943.24 mg/100 g。當檸檬酸濃度大于10%后，提取量降低。故選擇10%檸檬酸溶液的濃度為最佳提取溶劑。

2.2.2 超高壓壓力對玫瑰花色苷提取量的影響

圖3 壓力對花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of pressure on anthocyanins extraction

由圖3可知，在提取過程中花色苷提取量呈現出先上升后下降的變化趨勢。超高壓壓力在300 MPa時提取量最高，達到856.78 mg/100 g。當壓力大于300 MPa后，提取量降低，這是因為在壓力為300 MPa時，花色苷已經基本達到了溶解平衡狀態，再提升壓力，可能會使其他雜質釋放出來。故選擇壓力300 MPa時為最佳提取壓力。

2.2.3 保壓時間對玫瑰花色苷提取量的影響

圖4 保壓時間對花色苷提取量的影響Fig.4 Effect of dwell time on anthocyanins extraction

由圖4可知，花色苷提取量隨著時間的延長呈現出先增加后緩慢下降的變化趨勢。在保壓時間為9 min時提取量達到最高，為803.86 mg/100 g。再增加保壓時間，花色苷提取量開始緩慢下降，表明在9 min時花色苷已基本達到溶出的平衡狀態，而時間延長會增加能耗和使花色苷產生降解。故選擇的最佳保壓時間為9 min。

2.2.4 料液比對玫瑰花色苷提取量的影響

圖5 料液比對花色苷提取量的影響Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on anthocyanins extraction

由圖5可知，花色苷提取量隨料液比的增加呈現出先上升后下降的明顯變化趨勢。在料液比為1∶25(g/mL)時，花色苷提取量達到最高值945.14 mg/100 g，若繼續增大料液比，花色苷提取量反而降低。從提取效果和溶劑成本的角度綜合考慮，選用1∶25(g/mL)為最佳料液比。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗方案設計與結果

根據單因素試驗的結果，響應面試驗設計與結果見表 2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

續 表

應用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2的試驗數據進行多元回歸擬合分析，得到超高壓提取條件與玫瑰花色苷提取量間的多項式回歸方程：

Y=871.25+112.55A+8.61B-37.11C+17.37D-45.96AB-18.41AC+3.97AD-53.94BC+92.89BD+11.25CD-70.33A2+1.73B2+44.08C2-44.57D2。

對回歸方程進行了顯著性檢驗分析，結果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

續 表

注：“**”表示差異極顯著(P<0.01)；“*”表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，花色苷提取率試驗設計該模型整體呈極顯著(P<0.0001)，能夠正確反映玫瑰花色苷提取量(Y)與檸檬酸濃度(A)、壓力(B)、保壓時間(C)及料液比(D)之間的關系；失擬項不顯著(P=0.4008>0.05)；一次項A，C，D和二次項A2，C2，D2對響應值的影響均極顯著(P<0.01)，交互項AB，AC，BC，BD極顯著(P<0.01)。該試驗模型R2=0.9952，RAdj2=0.9905，表明此模型可以解釋99.05%響應值Y的真實變化，試驗誤差小，表明模型的選擇是合理的。各單因素對響應值Y的影響大小順序為A>C>D>B。

2.3.2 兩因素間的交互作用分析

由表3 可知，AB，AC，BC和BD的交互作用呈極顯著，其響應曲面圖見圖6。由圖6中2個參數響應面的陡峭曲面程度可知，在固定檸檬酸濃度和保壓時間在零水平時，料液比和壓力交互作用最顯著(圖6中a)，其次依次是壓力和保壓時間(圖6中b)、壓力和檸檬酸濃度(圖6中c)、保壓時間和檸檬酸濃度(圖6中d)。

圖6 兩因素交互作用對花色苷提取量的影響Fig.6 Response surface plots of variable parameters on anthocyanins extraction

2.3.3 最佳工藝條件

對試驗結果進行工藝優化，得到最佳試驗條件為：檸檬酸濃度13.2%，提取壓力400 MPa，保壓時間6 min，料液比為1∶25(g/mL)；在此條件下進行驗證，花色苷提取量為1089.42 mg/100 g，與預測值相近，說明用Box-Behnken響應面法能較好地反映超高壓條件下玫瑰花色苷的提取量。

2.4 玫瑰花色苷穩定性試驗結果

2.4.1 pH對玫瑰花色苷穩定性的影響

圖7 pH對玫瑰花色苷穩定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of rose anthocyanins

由圖7可知，在玫瑰花色苷溶液pH值為1～8的條件下，為pH值在1～3范圍時，吸光值變化不明顯，當pH值為4時，吸光值開始呈現下降趨勢，在pH值達到5以后，吸光值開始顯著下降。玫瑰花色苷在pH值為1～3的條件下穩定性較好，更適合花色苷的加工與儲藏。

2.4.2 溫度對玫瑰花色苷穩定性的影響

圖8 溫度對玫瑰花色苷穩定性的影響Fig.8 Effect of temperature on the stability of rose anthocyanins

由圖8可知，玫瑰花色苷在20～60 ℃范圍時，在溫度升高和時間延長的同時，花色苷溶液的顏色和吸光值沒有顯著的變化，從 80 ℃開始，吸光值變化較為明顯，溶液顏色變成淺粉色，到了100 ℃時變化則更加大，溶液幾乎變成無色。因此玫瑰花色苷不宜在高溫的環境下保存和使用，而在60 ℃內熱穩定性良好。

2.4.3 常見金屬離子對玫瑰花色苷穩定性的影響

圖9 金屬離子對玫瑰花色苷穩定性的影響Fig.9 Effect of mental ions on the stability of rose anthocyanins

由圖9可知，Na+，K+對花色苷無顯著變化，隨著離子濃度的增加與時間的延長吸光值略有增加，溶液顏色變成淺紅色，Al3+，Ca2+，Cu2+對花色苷有顯著增色效應，吸光值明顯增加，顏色變為鮮艷的玫瑰紅色。Zn2+的吸光值與溶液顏色幾乎無變化，Mg2+和Fe3+能夠破壞花色苷的結構，使其降解，而含有Fe3+的溶液顏色變為暗綠色。因此，應避免花色苷與Mg2+和Fe3+的接觸。

2.4.4 氧化劑和還原劑對玫瑰花色苷穩定性的影響

(a)不同濃度過氧化氫對玫瑰花色苷穩定性的影響

(b)不同濃度亞硫酸鈉對玫瑰花色苷穩定性的影響圖10 氧化劑和還原劑對玫瑰花色苷穩定性的影響Fig.10 Effects of oxidant and reducing agent on the stability of rose anthocyanins

由圖10可知，H2O2和Na2SO3對花色苷的穩定性影響極大。加入Na2SO3溶液的吸光度急劇下降，顏色馬上變為無色，加入H2O2溶液的破壞速度相對要遲緩，但加入H2O2濃度較高的溶液4 h后也變為無色。因此，玫瑰花色苷在生產加工和貯藏的過程中應避免與氧化劑和還原劑的接觸。

3 結論

本文用響應面法對玫瑰花色苷的超高壓提取條件進行優化，并且研究了玫瑰花色苷的穩定性。優化得到花色苷的最佳提取工藝參數為：檸檬酸濃度13.2%，壓力400 MPa，保壓時間6 min，液料比1∶25(g/mL)，此條件下玫瑰花色苷提取量為1089.42 mg/100 g，與常用花色苷提取方法相比，提高了69.52%。穩定性研究的結果表明：玫瑰花色苷在pH為1～3的條件下比較穩定，60 ℃內的穩定性良好；氧化劑和還原劑會顯著加快花色苷的降解，Zn2+，Na+，K+對花色苷無顯著變化，Mg2+，Fe3+能夠破壞花色苷的結構，使其降解，Al3+，Ca2+，Cu2+對花色苷有顯著增色效應。因此，對玫瑰花色苷的開發利用，研制出高附加值產品，將會帶動玫瑰產業的快速可持續發展。