響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓輔助提取紫薯花色苷的工藝研究

陳亞利,嚴成,張唯,陳燁,楊雁

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

紫薯(IpomoeabatatasPoir.)，又稱黑薯、烏心苕等，培育最早起源于日本。因其產(chǎn)量高、適應(yīng)性強，我國于20世紀90年代從日本引種栽植[1]。紫薯富含花色苷，其具有藥用價值及保健功能，如提高人體免疫力、抗腫瘤、抗衰老及預(yù)防和治療高血壓等功效[2-6]，故一直被人們所重視。同時，花色苷又是天然的水溶性色素，因其無毒無害，且相比其他色素更穩(wěn)定，故一直被作為食用類色素添加到食品中。從現(xiàn)有的報道中可知，對紫薯花色苷的研究多集中在提取及結(jié)構(gòu)鑒定方面[7-11]，常見的提取方法主要有溶劑法[12,13]、超聲波輔助提取法[14-16]、微波輔助提取法[17]、酶法等，其普遍具有耗時耗能的特點。超高壓技術(shù)作為食品行業(yè)中非熱加工技術(shù)，近些年，在物質(zhì)有效成分提取方面有所應(yīng)用，因其與傳統(tǒng)提取方法相比，具有能耗低、提取時間短、作用溫度低等特點而深受重視，但在紫薯花色苷的提取方面鮮有報道，故本文選用此法。以紫薯粉為原料提取花色苷，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，分析提取劑濃度、料液比、壓力值、保壓時間等因素對花色苷得率的影響，以期為超高壓技術(shù)在紫薯花色苷提取方面的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯：2017年10月由四川省劍閣縣成一食品有限公司種植基地提供。

檸檬酸等試劑：均為分析純。

BSA224S 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；D2-280/2SE 小型真空封裝機 東莞市益健包裝機械有限公司；多功能粉碎機 浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司；電熱恒溫干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HPP.L2-800/1 超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；UV-3150紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；臺式離心機 天津廣豐科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原材料預(yù)處理

挑選新鮮、無病蟲害的紫薯清洗，去皮，切片，在50 ℃電熱恒溫干燥箱烘干，粉碎，過80目篩，置于棕色試劑瓶中，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 超高壓提取條件

超高壓設(shè)備的有效體積為1 L，最高壓力值為700 MPa，癸二酸二辛酯為傳壓介質(zhì)，升壓速率為100 MPa/15 s，油溫22 ℃，保壓過程中壓力差不超過10 MPa，解壓時間10 s。

1.2.3 花色苷最大吸收波長的確定

準確稱取紫薯粉1.00 g，置于聚乙烯袋中，按照料液比1∶30(g/mL)加入30 mL提取溶劑(1%檸檬酸溶液)，真空包裝，于300 MPa條件下提取5 min，得到紫薯花色苷粗提液，吸取少量上清液離心，取上清液稀釋適當倍數(shù)，在300～600 nm下進行光譜掃描，以獲得最大吸收波長。

1.2.4 總花色苷含量的計算

采用消光系數(shù)法，按照下式計算花色苷的含量(本文又稱得率)：

總花色苷含量(mg/100 g)=(A×V×n)/(m×98.2)×100。

式中:A為吸光度;V為提取液體積;n為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量;98.2為紫薯色素的摩爾消光系數(shù)，在進行對比實驗時實驗中產(chǎn)生的誤差可以忽略掉。

1.2.5 超高壓輔助提取方法

準確稱取處理后的紫薯粉1.00 g，置于聚乙烯袋中，在室溫下按照設(shè)定的料液比、壓力值、保壓時間等，使用不同濃度的檸檬酸水溶液作為提取劑提取花色苷，離心，取上清液稀釋一定的倍數(shù)，在526 nm波長下測定其吸光值，重復(fù)3次求平均值，依據(jù)1.2.4中公式計算紫薯中花色苷的得率。

1.2.6 溶劑提取方法

根據(jù)預(yù)實驗正交結(jié)果，按料液比1∶30(g/mL)取一定量的紫薯粉，加入2.0%的檸檬酸溶液，在60 ℃下提取2 h，離心，測定吸光值，按1.2.4中公式計算紫薯中花色苷的得率。

1.2.7 單因素試驗

分別以不同濃度檸檬酸水溶液(0.20%，0.40%，0.60%，0.80%，1.00%，1.20%，1.60%，1.80%，2.00%)、料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50)、提取壓力(100，150，200，250，300，400，500 MPa)、保壓時間(1，3，5，7，10 min)為自變量，以花色苷提取得率為考量值，通過控制變量法，進行單因素試驗，確定響應(yīng)面分析法各個因素的取值范圍。

1.2.8 響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取法

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定的各個因素的零水平和波動區(qū)，以花色苷的得率為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.6.1軟件建立4因素3水平Box-Behnken中心組合試驗，試驗因素與水平取值見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平編碼表Table 1 The factors and levels of response surface experiment

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.6.1和Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇

按照1.2.3的提取方法，在300～600 nm波長范圍內(nèi)掃描紫薯花色苷色素粗提液，測定粗提液的光譜吸收特性，結(jié)果見圖1。紫薯色素粗提液在526 nm處有最大吸收，查閱文獻[19]可知，在520～540 nm有1個吸收峰，為典型的花色苷色譜特性，因此選526 nm為測定紫薯花色苷含量的檢測波長。

圖1 紫薯花色苷紫外-可見光掃描圖譜Fig.1 UV-visible light scanning spectrum ofpurple potato anthocyanins

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取劑濃度對紫薯花色苷得率的影響

圖2 檸檬酸水溶液濃度對花色苷得率的影響Fig.2 Effect of different concentration of citric acid solution on the yield of anthocyanins

由圖2可知，檸檬酸濃度為1.8%時提取效果最好，濃度小于1.8%時，隨著檸檬酸濃度的增大，提取效率增加；濃度大于1.8%時，提取效率呈下降趨勢，這一變化與花色苷糖基在酸性條件下的穩(wěn)定性有關(guān)。當濃度過大時，花色苷酰基化結(jié)構(gòu)會遭到破壞，導(dǎo)致提取率降低。此外提取劑濃度過大，增加了后續(xù)脫味處理的難度，所以選擇檸檬酸溶液濃度1.8%為花色苷的最佳提取濃度。

2.2.2 壓力值對紫薯花色苷含量的影響

圖3 壓力值對花色苷得率的影響Fig.3 Effect of different pressure values on the yield of anthocyanins

由圖3可知，花色苷的得率在壓力值為100～250 MPa間，隨著壓力的增加而增加，在250 MPa時達到峰值，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能是由于在加壓提取過程中，升壓增加了提取劑固體組織的滲透速率，細胞膜和細胞壁被破壞的數(shù)量增加，提取劑和組織接觸的面積增大，使得有效成分的溶解更加完全[20]。下降的原因可能是壓力過大使花色苷有效成分受到破壞，故選擇250 MPa進行下一步試驗。

2.2.3 保壓時間對紫薯花色苷含量的影響

圖4 保壓時間對花色苷得率的影響Fig.4 Effect of different dwell time on the yield of anthocyanins

由圖4可知，0～5 min花色苷的得率隨著保壓時間的延長而增加，在5 min時達到最大值，之后開始下降，原因可能是在高壓狀態(tài)下，有效成分快速擴散到溶劑中達到了一個平衡，過了這個臨界點有效成分受到破環(huán)，從而降低了提取效果，故選擇5 min為最佳保壓時間進行后續(xù)試驗。

2.2.4 料液比對紫薯花色苷含量的影響

圖5 料液比對花色苷得率的影響Fig.5 Effect of different solid-liquid ratios on the yield of anthocyanins

由圖5可知，隨著料液比的增加，花色苷的得率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。料液比在1∶10～1∶30(g/mL)之間，花色苷的得率都呈現(xiàn)上升趨勢，原因是適當增加提取劑的用量，能夠更好地促使花色苷的溶出，從而提高得率[21]。當料液比為1∶30(g/mL)時，花色苷的得率最大，之后隨著料液比繼續(xù)增加，提取率略有下降。因此，選取1∶30為最佳的料液比。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，建立4因素3水平Box-Behnken中心組合試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Exprimental design and results of response surface analysis

續(xù) 表

采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得到提取劑濃度、料液比、保壓時間和壓力4個因素的二次多項回歸方程為：Y=80.33+1.23A+2.81B-0.44C+0.30D-0.99AB-0.28AC-0.80AD-1.76BC-1.62BD-0.14CD-1.74A2-1.71B2-0.6C2-0.91D2。

式中：Y為花色苷得率的預(yù)測值；A，B，C，D分別代表提取劑濃度、料液比、保壓時間、壓力的編碼值，為了說明模型的可行性，對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

由表3可知，模型的P<0.0001，說明回歸模型差異極顯著。模型的失擬項檢驗差異不顯著(P>0.05)，信噪比(S/N=31.233)大于4，可知回歸方程有極好的擬合度和可信度，能反映出提取劑濃度、料液比、保壓時間和壓力值與花色苷得率之間的關(guān)系。

模型的決定系數(shù) R2= 0.9812(R2>0.8000)，表明該模型可以解釋98.12%響應(yīng)值的變化，即樣本數(shù)據(jù)對模型回歸方程的擬合性較高，該模型的選擇是合理的，故此模型可用作對紫薯花色苷提取結(jié)果進行分析預(yù)測。

此模型中 A，B，C，AB，AD，BC，BD，A2，B2，C2，D2為差異極顯著項(P<0.01)，其他項差異均不顯著。B的F值最大，其次是A和C，D相對較小，表明4個因素對花色苷得率的影響大小順序為B>A>C>D，即料液比>提取劑濃度>保壓時間>壓力。

通過交互作用分析，AB，AD，BC，BD項有顯著交互作用，即提取劑濃度和料液比、提取劑濃度和壓力、料液比和保壓時間、料液比和壓力存在顯著交互作用，對兩組因素進行響應(yīng)面分析，考察因素間的交互規(guī)律。

通過響應(yīng)面軟件最優(yōu)組合分析得到花色苷提取的最佳工藝條件為：提取劑濃度2.0%、料液比1∶40、保壓時間3 min、壓力值200 MPa。

2.3.2 各因素之間交互作用

圖6 提取劑濃度和料液比對花色苷得率影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of extractant concentration and solid-liquid ratio on the yield of anthocyanins

由圖6可知，提取劑濃度與料液比之間的交互作用，等高線呈橢圓形，提取劑濃度與料液比對花色苷得率影響的交互作用極顯著(P<0.0001)，提取劑濃度一定時，隨著料液比的增加，花色苷的得率呈先上升后下降的趨勢；料液比一定時，隨著提取劑濃度的增加，花色苷的得率先上升后下降。

提取劑濃度與壓力之間的交互作用見圖7。

圖7提取劑濃度與壓力對花色苷得率影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of extractant concentration and pressure on the yield of anthocyanins

等高線呈橢圓形，提取劑濃度與壓力對花色苷得率影響的交互作用極顯著(P<0.0060)，提取劑濃度一定時，隨著壓力的增加，花色苷的得率呈先上升后下降的趨勢；壓力一定時，隨著提取劑濃度的增加，花色苷的得率先上升后下降，但總的變化較小。

料液比與保壓時間之間的交互作用見圖8。

圖8 料液比與保壓時間對花色苷得率影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of solid-liquid ratio and dwell time on the yield of anthocyanins

等高線呈橢圓形，料液比與保壓時間對花色苷得率影響的交互作用極顯著(P<0.0001)，保壓時間一定時，隨著料液比的增加，花色苷的得率呈一直增加的趨勢；料液比一定時，隨著保壓時間的增加，花色苷的得率先上升后下降，說明料液比對花色苷得率的影響比保壓時間的影響更大。

料液比與壓力值之間的交互作用見圖9。

圖9 料液比與壓力值對花色苷得率影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface of solid-liquid ratio and pressure on the yield of anthocyanins

等高線呈橢圓形，料液比與壓力值之間的交互作用對花色苷得率影響的交互作用極顯著(P<0.0001)，壓力一定時，隨著料液比的增加，花色苷的得率呈增加的趨勢；料液比一定時，隨著壓力的增加，花色苷的得率先上升后下降，料液比對花色苷得率的影響比壓力值的影響更顯著。

2.4 驗證性試驗

為驗證響應(yīng)面所得結(jié)果的可靠性，根據(jù) Design Expert 軟件，預(yù)測出花色苷提取的最佳工藝條件：提取劑濃度為2.0%，料液比為1∶40，保壓時間為3 min，壓力值為200 MPa，并對其進行驗證，經(jīng)過3次平行試驗后，得到花色苷的含量為82.67 mg/100 g，與理論值接近(82.85 mg/100 g)，誤差較小。故用響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到的花色苷提取條件與實際擬合較好，具有可靠性和實用價值。

2.5 超高壓輔助法提取與溶劑提取法的對比

超高壓輔助法提取與溶劑提取法的對比結(jié)果見表4。

表4 兩種方法比較Table 4 Comparison of two methods

由表4可知，超高壓輔助提取法不僅提取溫度要求低且耗時短，提取效果也高于溶劑提取法。

3 結(jié)論

超高壓輔助提取紫薯花色苷，具有作用溫度低、耗時短、得率高的特點，對于花色苷的提取是一種不錯的選擇。采用響應(yīng)面法對紫薯花色苷超高壓輔助提取工藝進行優(yōu)化，根據(jù)響應(yīng)面模型得出的最佳工藝條件為提取劑濃度2.0%，料液比1∶40，保壓時間3 min，壓力值200 MPa，花色苷含量82.85 mg/100 g，驗證得到花色苷的含量為82.67 mg/100 g，與預(yù)測值十分接近；從三維圖及等高線圖可以看出，各因素間的交互作用對花色苷提取得率的影響較大。綜上，響應(yīng)面法能對花色苷提取工藝進行較好的優(yōu)化。此外，為更好地將超高壓技術(shù)應(yīng)用到活性物質(zhì)的提取中，還應(yīng)進行超高壓對各因素影響的研究，這也是本實驗的不足之處，故后續(xù)還需開展此方面的研究。