LXA4、TNF-及其比值與子癇前期發生發展的相關性研究

王 莉，丁依玲

(1.海南省人民醫院產科，海南 海口 570000；2.中南大學湘雅二院產科，湖南 長沙 410000)

子癇前期(preeclampsia，PE)的發生發展，特別是子癇的發生可以導致患者病死率的上升，并促進最終不良臨床結局的發生。流行病學研究顯示PE的發病率可達0.6%～1.8%，特別是在部分地區的人群中的發病率更高[1]。在探討PE發病機制的過程中發現，細胞炎癥因子等生物學因子激活導致的氧化應激障礙或者代謝性損傷等，均可以促進PE患者的病情進展。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-)等，可以通過激活下游炎癥因子IL-6等的上調，促進胎盤血管內皮的損傷，加劇胎盤血管的螺旋化等重塑性障礙，導致血流動力學紊亂[2-4]。為了進一步揭示LXA4、TNF-在PE發病機制過程中的作用，本研究選取PE產婦78例，探討相關指標在胎盤及血清中的異常表達，報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年2月至2017年2月在海南省人民醫院分娩的PE產婦78例，其中輕度PE產婦45例(輕度PE組)，重度PE產婦33例(重度PE組)，納入標準：①診斷符合謝幸等主編的《婦產科學》(第8版)標準；②自愿提供胎盤組織；③單胎妊娠初產婦；④產婦及家屬知情同意并簽署同意書。排除標準：①合并胎膜早破、前置胎盤等產科其他合并癥；②有糖尿病、甲狀腺功能亢進、血液系統疾病等；③近1個月內服用過抗炎藥物或免疫抑制類藥物。同時選取正常產婦50例作為對照組，對照組、輕度PE組和重度PE組產婦年齡、孕周、孕次等一般資料差異無統計學意義，見表1。

組別例數(n)年齡(歲)孕周(周)孕次(次)對照組5026.03±3.4138.21±2.061.24±0.41輕度PE組4525.94±2.8038.04±1.971.20±0.24重度PE組3326.06±3.0438.17±2.161.31±0.34F1.0672.0441.874P>0.05>0.05>0.05

1.2酶聯免疫吸附測定

采取兩組患者靜脈血用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測LXA4、TNF-水平，采用低溫高速離心機進行離心，1 000r/min(離心半徑為15cm)，獲得血清后抽取50μL樣品加入96孔板內，采用去離子水作為陰性對照，采用50μL磷酸鹽緩沖液作為陽性對照，平衡搖晃20s混勻，室溫下孵育2h，采用磷酸二鈉緩沖液(TBST)清洗3次，每次5min，加入100μL底物，平衡搖晃30～45s，25℃室溫下孵育40min，加入250μL終止物，直到96孔板中每孔的顏色變黃，最后以空白對照為基準，采用分光光度計進行讀數。LXA4、TNF-抗體購自羅氏檢測公司，相關配套試劑購自南京凱基生物科技有限公司，嚴格按照說明書的要求進行操作。

1.3免疫組化檢測

采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3mm，3%H2O2室溫孵育5min，采用去離子水沖洗3次，每次3min，采用濃度為10%牛奶蛋白(1g蛋白加入100mL純水)封閉，室溫孵育5min，加入LXA4受體和TNF-抗體(鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司)，37℃孵育2h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗(兔來源，購自羅氏檢測公司)，37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min，加入溴甲酚紫指示劑，顯色5min，復染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。

1.4結果判斷

采用Fromowitz綜合計分法，蛋白陽性表達位于細胞胞漿內，呈棕黃色顆粒。隨機選取5個高倍鏡視野，計數滋養細胞總數及陽性細胞總數，根據陽性細胞比例計分，比例<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度為無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；總分=染色強度得分×細胞比例得分，>2分為陽性，≤2分為陰性。

1.5統計學方法

2結果

2.1各組胎盤組織LXA4受體和TNF-表達

輕度PE組和重度PE組LXA4受體蛋白陽性表達率分別為55.55%和60.61%，明顯低于對照組，差異均有統計學意義(χ2值分別為19.077、14.246，均P<0.05)，而TNF-蛋白陽性表達率分別為80.00%和81.82%，明顯高于對照組，差異均有統計學意義(χ2值分別為25.688、23.035，均P<0.05)，見表2和圖1。

表2各組胎盤組織LXA4受體和TNF-表達[n(%)]

Table 2 Expressions of LXA4 receptor and TNF-in placenta in each group[n(%)]

Table 2 Expressions of LXA4 receptor and TNF-in placenta in each group[n(%)]

組別例數(n)LXA4受體蛋白陽性表達TNF-α蛋白陽性表達對照組5047(94.00)14(28.00)輕度PE組4525(55.55)a36(80.00)a重度PE組3320(60.61)a27(81.82)aχ220.10935.424P<0.05<0.05

注：a與對照組比較P<0.05。

注：A和D為對照組LXA4受體和TNF-表達；B和E為輕度PE組LXA4受體和TNF-表達；C和F為重度PE組LXA4受體和TNF-表達。

圖1免疫組化圖

Fig.1 Immunohistochemistry image

2.2各組血清LXA4、TNF-比較

輕度PE組血清LXA4明顯高于對照組和重度PE組，差異均有統計學意義(t值分別為12.163、10.476，均P<0.05)；輕度PE組和重度PE組TNF-明顯高于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為48.500、37.304，均P<0.05)；重度PE組LXA4/TNF-明顯低于對照組和輕度PE組，差異均有統計學意義(t值分別為25.271、16.106，均P<0.05)；輕度PE組LXA4/TNF-明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=16.970，P<0.05)，見表3。

2.3相關性分析

表3各組血清LXA4、TNF-比較

Table 3 Comparison of serum LXA4 and TNF-

Table 3 Comparison of serum LXA4 and TNF-

注：a與對照組比較P<0.05；b與重度PE組比較P<0.05。

3討論

3.1子癇前期的背景相關研究

飲食習慣的改變、遺傳易感因素及高脂血癥等，均可以促進子癇前期的發生發展，特別是在具有高血壓家族史的患者中，子癇前期的發病率可較普通對照人群上升3～4倍[5]。子癇前期的長期發展，可以導致孕產婦妊娠中晚期發生胎盤早剝、產后出血及產褥期并發癥的發生，臨床預后不佳。解痙、降壓、肝素抗凝等綜合性治療，雖然可以在一定程度上抑制病情的進展，但治療的總有效率不足35%，患者的病情進展率仍然可達40%以上。而對于子癇前期發病過程中的相關機制的探討，可以為疾病的生物學治療提供理論基礎，從而提高子癇前期的治療效果。

3.2 LXA4及TNF-α的異常表達與子癇前期發病的潛在關系

LXA4可以通過增加胎盤血管內皮細胞的氧化損傷，促進絨毛膜滋養細胞凋亡和蛻膜組織的退行性病變，進而導致子癇前期的發生發展。特別是對于胎盤血管的螺旋化、弓狀血管的重塑等生理過程的影響，可以導致胎盤血管的血流灌注阻力的增加，促進病情的進展[6-7]。TNF-作為細胞炎癥因子，其可以通過激活下游單核細胞、巨噬細胞等的上調，促進炎癥細胞對于胎盤組織的浸潤[8-10]，加劇了胎盤血管的螺旋化病理改變、促進血流動力學障礙，血流呈現出明顯的高阻力、低灌注表現，從而影響血壓波動[11-12]。已有的研究探討了LXA4及TNF-的異常表達，但多數研究局限于血清學資料的對比研究，缺乏對胎盤組織中相關蛋白水平的表達研究。

3.3 LXA4及TNF-α的異常表達在促進子癇前期患者病情進展過程中的作用

本研究發現，在胎盤組織中，LXA4受體的陽性表達水平較低，低于正常對照組人群，差異具有統計學意義，提示LXA4受體的異常表達可能促進了子癇前期患者的病情進展，LXA4受體數量或者敏感性的改變，可以通過影響胎盤組織的氧化應激障礙、促進炎癥反應等，進而導致血壓的波動，促進腎臟等多器官的損傷；在胎盤組織中，可發現TNF-蛋白的陽性表達率較高，高于正常對照人群，TNF-的高表達可以通過激活下游IL-6或IL-10等，加劇局部線粒體能量利用障礙，促進胎盤微血管的損傷。王素梅等[13]和張俊農等[14]在探討重度子癇前期患者的發病機制的過程中發現，TNF-等的激活是促進PE患者病情進展的持續性核心因素，其中胎盤組織中TNF-的表達陽性率可平均上升25%以上，患者的血壓控制效果越差、病情越嚴重，相關指標的表達越高。在探討血清學相關指標的改變過程中發現，輕度和重度PE組TNF-明顯高于對照組，TNF-在胎盤組織或者血清中均呈現出明顯的高表達趨勢，提示TNF-的表達能夠顯著促進患者病情的進展，這主要由于TNF-的表達提高了血管內皮的損傷程度，進一步導致血管的痙攣和血壓的上升[12]。但本研究并未發現LXA4在血清中表現出同樣的低表達趨勢，結果顯示輕度PE組血清LXA4明顯高于對照組和重度PE組，差異具有統計學意義，考慮可能與LXA4的受體敏感性或正反饋調控障礙等有關，也可能與本研究的樣本量較少有關。LXA4/TNF-可以有效評估患者的病情，重度組患者的LXA4/TNF-明顯低于輕度組，而輕度組LXA4/TNF-也明顯低于正常對照組。相關關系分析也發現，LXA4與TNF-具有密切的關系，同時LXA4/TNF-與PE患者病情呈負相關，患者的病情越嚴重，LXA4/TNF-的指標越低。

3.4總結

本研究的創新性在于探討了LXA4受體水平的表達異常，同時揭示了胎盤組織中LXA4等因子的表達變化，相關關系分析也可以進一步揭示不同炎癥因子的致病機制。綜上所述，PE患者血清LXA4和TNF-，以及胎盤組織LXA4受體和TNF-表達異常，可能與疾病的發生發展有關，其中LXA4/TNF-比值可在一定程度上反映病情程度。