小麥種質資源農藝性狀遺傳分析及白粉病抗性鑒定

王掌軍，劉 妍，王 姣，付青青，劉鳳樓，張雙喜，張文杰，張曉崗，劉生祥

(1.寧夏大學 農學院, 寧夏 銀川 750021； 2.寧夏農林科學院 農作物研究所，寧夏 銀川 750001)

【研究意義】由于長期的人工選擇和栽培，導致小麥大量優異基因丟失及遺傳基礎日趨狹窄、脆弱，進而限制了小麥產量和品質的提高，同時，由于育種家一貫追求矮稈、高產的育種目標，加之近年來水肥條件和群體密度提高且品種單一化種植，使得小麥極易受到全球氣候變化和病、蟲害的侵染[1-2]。收集和利用種質資源是拓寬小麥遺傳多樣性的基礎，同時，種植抗病品種是防治小麥白粉病最經濟、有效、環保的措施[3]。【前人研究進展】國內各地區從評選地方品種起步都選了一批優良地方品種在生產上推廣，建國以來，我國先后育成了大量的優良品種，每年在生產上種植的小麥品種近400個，種植面積在66.7萬hm2以上的品種累計有60多個[4]；同時積極從國外引入品種擇優與當地品種雜交，進而對小麥遺傳改良，效果顯著，尤其是矮稈基因的利用使株高降低、收獲指數提高、穗粒重增加，使得品種產量潛力有了巨大提高[5]。另外，經一些科技工作者的不懈努力，將小麥近緣種蘊含的抗病蟲害、抗逆、高蛋白等優異基因導入小麥背景中，在生產上發揮著巨大的作用[6-7]。自1930年，澳大利亞學者Waterhouse首次報道小麥品種 Thew 攜帶一對顯性抗病基因，以后各國科學家對抗小麥白粉病基因遺傳及染色體定位進行了廣泛的研究。小麥白粉病是由禾布氏白粉菌 (Blumeriagraminisf. sptritici) 引起的真菌病害，主要通過影響功能葉片的光合作用而造成小麥減產，在病害發生的一般年份可使小麥減產5 %～34 %[8]，而連續近3年白粉病成為寧夏春麥區小麥生產中的第一大病害，抗白粉病基因的發掘和利用是小麥育種工作的當務之急。目前，國際上正式命名了54個位點(Pm1～Pm54)，鑒定出78個抗白粉病基因，主要來源于普通小麥本身及小麥近緣種屬，并且多數基因在染色體上有明確定位[9-13]。尤其攜帶Pm8、Pm17和Pm20等抗白粉病基因的小麥-黑麥1RS/1BL易位系在世界小麥育種中應用最為廣泛[14-17]。近年來，攜帶Pm21基因的小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系已廣泛應用于國內小麥育種中，育成了一系列抗白粉病的品種[18-21]。【本研究切入點】本研究針對寧夏小麥品種資源相對匱乏及本地小麥品種抗病性差等特點，而連續近3年白粉病成為寧夏春麥區小麥生產中的第一大病害。而且寧夏現有的自育和外引小麥材料在農藝性狀和抗白粉病基因分布方面缺乏系統的鑒定資料。【擬解決關鍵問題】對不同來源、不同倍性的小麥種質從農藝性狀和白粉病抗性進行鑒定，以期鑒定一批農藝性狀優良、抗病性強的材料為豐富當地小麥種質資源遺傳多樣性及在育種上利用，為抗白粉病分子標記輔助選擇奠定基礎，以及明確白粉病抗性基因的合理布局和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料共81份(表1)，包括24份地方品種(寧夏6份，外省12份，國外6份)、57份育成品種(寧夏28份，外省29份)，均由寧夏大學小麥育種課題組提供。2016年3月7日將其種植于寧夏大學教學實驗農場，每個材料種植1個小區，每小區5行，行長1.1 m，行寬0.2 m，生育期管理同大田。詳細觀察記載各材料的生長特性、生育時期和形態性狀。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間觀察記載 記載各個生育時期(包括出苗期、分蘗期、拔節期、孕穗期、抽穗期、開花期、灌漿期、成熟期等)，并對不同時期性狀觀察記錄(包括抗病性、株型、抗倒伏等)。

1.2.2 農藝性狀考察 株高、穗下莖長和穗長采用直接測量法，用卷尺測量，在考種表上直接記錄。有效穗數為每個單株上總的穗數；小穗數和結實小穗數采用直接觀測法，其中，結實小穗數=有效小穗數-不孕小穗數。穗粒數和穗粒重以每個株系隨機選取15個單穗的粒數并稱重，分別取其平均值作為穗粒數和穗粒重；千粒重為1000粒種子稱重(3次重復)。經濟系數為收獲小區全部單株，經濟系數=經濟產量/生物學產量，其中，生物學產量為收獲后未脫粒前的植株(中途未取樣的小區)重量，經濟產量為脫粒后的籽粒重量。株型分為直立、松散和倒伏3個類型。芒性為長芒、短芒、頂芒和無芒類型。

1.2.3 分子標記分析 基因組DNA的提取采用SDS法[22]。根據已發表的白粉病抗性基因標記設計引物(表2)，由上海生工生物有限公司合成。PCR反應體系(10 μl)：10× Reaction Buffer 1 μl，MgCl2(25 mmol·L-1)0.8 μl，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.8 μl，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μl，模板DNA 50 ng，TaqDNA聚合酶0.5 U，加ddH2O至總體積10 μl。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物檢測：采用8 %聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳時總電壓為150 V，電泳1.5 h左右，經銀染后觀察并照相，并統計擴增條帶。

表1 小麥供試材料名稱、來源、系譜

表2 白粉病抗性基因標記信息

1.2.4 白粉病成株期田間鑒定 種植引自長江中下游感白粉病品種“蘇麥3號”誘發繁殖白粉病，采用收集于寧夏地區的白粉菌混合小種接種于分蘗期小麥。抽穗期分級標準參考0～9級的分級標準，即：0級為免疫(immue, I)、 0;級近免疫(nearly immue, NI)、1～2級高抗(highly resistant, HR)、3～4級中抗(moderate resistant, MR)、5～6級中感(modrate susceptible, MS)、7～8級高感(highly susceptible, HS)、9級極感(extremely susceptible, ES)[32]。

1.2.5 數據處理 采用Microsoft Excel 2010處理數據并作圖，用DPS 7.05進行差異顯著性、相關性和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 小麥種質資源農藝性狀變異及相關性分析

2.1.1 農藝性狀的變異 對81份小麥種質10項指標統計分析，由表3表明，其中，9個農藝性狀變異系數依次為有效穗(14.77 %)﹥穗粒重(14.41 %)﹥穗粒數(8.94 %)﹥穗下莖長(7.03 %)﹥結實數(5.69 %)﹥小穗數(5.03 %)﹥穗長(4.98 %)﹥株高(3.21 %)﹥千粒重(0.65 %)；同時，株高、穗下莖長和有效穗的變異幅度較大，分別達到極顯著、極顯著和顯著水平。

表3 小麥農藝性狀變異性分析

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平的F值。

Note: * and ** meanFvalue at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

表4 小麥農藝性狀相關分析

注：* 和 ** 分別表示在0.05和0.01水平的顯著相關。

Note: * and ** mean significant correlation at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

2.1.2 農藝性狀間的相關性 對10項農藝性狀指標間進行相關性分析，從表4中看出，株高與所有其他性狀相關性不明顯；穗下莖長與有效穗(相關系數為0.73)、穗長(0.31)、小穗數(0.24)、結實數(0.24)，有效穗與穗長(0.35)，穗長與小穗數(0.32)、結實數(0.28)、穗粒數(0.22)、穗粒重(0.18)，小穗數與結實數(0.95)、穗粒數(0.45)、穗粒重(0.24)，結實數與穗粒數(0.49)、穗粒重(0.26)，穗粒數與穗粒重(0.74)，穗粒重與千粒重(0.41)、經濟系數(0.40)，千粒重與經濟系數(0.63)，以上農藝性狀指標間均呈極顯著正相關。其他性狀間相關性不顯著或為不同程度負相關。

2.2 小麥種質資源基于農藝性狀的聚類分析

以株高、穗下莖長、有效穗等10項農藝性狀指標的考種數值進行聚類分析，在距離為21.83時，將81份供試材料分為7個(Ⅰ～Ⅶ)類群，其中，第Ⅰ類群包括22份材料、第Ⅱ類群包括54份材料、第Ⅲ～Ⅶ類群各為1份材料(圖1)。

農藝性狀類群間分析表明：株高(圖2A)，群組Ⅰ﹥Ⅶ﹥Ⅵ﹥Ⅳ﹥Ⅲ﹥Ⅴ﹥Ⅱ；穗下莖長(圖2B)，Ⅲ﹥Ⅵ﹥Ⅰ﹥Ⅳ﹥Ⅴ﹥Ⅱ﹥Ⅶ；有效穗(圖2C)，Ⅰ﹥Ⅱ﹥Ⅲ=Ⅵ=Ⅶ﹥Ⅴ﹥Ⅳ；穗長(圖2D)，Ⅵ﹥Ⅰ﹥Ⅱ﹥Ⅲ﹥Ⅳ﹥Ⅴ﹥Ⅶ；小穗數(圖2E)，Ⅶ﹥Ⅴ=Ⅵ﹥Ⅳ﹥Ⅰ﹥Ⅱ﹥Ⅲ；結實小穗數(圖2F)，Ⅶ﹥Ⅴ﹥Ⅵ﹥Ⅳ﹥Ⅰ﹥Ⅱ﹥Ⅲ；穗粒數(圖2G)，Ⅵ﹥Ⅶ﹥Ⅴ﹥Ⅱ﹥Ⅰ﹥Ⅲ﹥Ⅳ；穗粒重(圖2H)，Ⅵ﹥Ⅴ﹥Ⅶ﹥Ⅱ﹥Ⅲ﹥Ⅰ﹥Ⅳ；千粒重(圖2I)，Ⅵ﹥Ⅱ﹥Ⅲ﹥Ⅰ﹥Ⅴ﹥Ⅳ﹥Ⅶ；經濟系數(圖2J)，Ⅵ﹥Ⅱ﹥Ⅲ﹥Ⅰ﹥Ⅶ﹥Ⅴ﹥Ⅳ。總體上，第Ⅰ類群的22份材料平均有效穗最多(6.83±1.986)個，第Ⅱ類群的54份材料平均株高最矮(83.94±13.429)cm，第Ⅲ類群的1份材料穗下莖節最長(51.50±0.500)cm，第Ⅵ類群的1份材料的穗長、穗粒數、穗粒重、千粒重、經濟系數均最高(11.00±2.370)cm、(61.00±4.359)粒、(2.69±0.303) g、(44.13±0.006) g、0.533，第Ⅶ類群的1份材料的小穗數和結實小穗數均最多(24.33±1.528)和 (23.33±1.528)個。

圖2 7群組小麥品種的農藝性狀指標Fig.2 Agronomic trait index of 7 group varieties of T.aestivum

2.3 小麥種質資源白粉病抗性基因的分布及抗病性鑒定

根據已發表的白粉病抗性基因Pm2、Pm4a、Pm6、Pm8、Pm12、Pm13、Pm16/Pm30、Pm21、Pm24等標記設計引物，檢測這些基因在81份小麥種質中的分布、并進行田間抗病性鑒定(圖3，表5)，其中，Pm12、Pm13、Pm16/Pm30、Pm24等4個基因標記均在供試材料中未擴增出特異性條帶。從表5可以看出，根據其他5個標記檢測結果分為5類： ①任何基因均未得以檢測的材料4份(編號9、10、11、19)；②僅一個基因得以檢測的材料11份，其中，Pm2 10份(編號12、15、36、41、50、54、57、58、60、78)、Pm8 1份(編號13)；③聚合2個基因的材料23份，其中，Pm2+Pm4a4份(編號14、53、59、79)、Pm2+Pm6 4份(編號27、42、46、81)、Pm2+Pm8 13份(編號17、20、23、32、35、37、38、39、43、45、51、52、61)、Pm2+Pm21 2份(編號66、74)；④聚合三個基因標記的材料38份，其中，Pm2+Pm4a+Pm8 16份(編號1、2、3、4、5、6、7、16、21、22、24、25、26、28、56、62)、Pm2+Pm4a+Pm21 10份(編號63、64、65、67、68、69、72、73、75、77)、Pm2+Pm6+Pm8 10份(編號8、18、29、30、31、33、34、44、47、48)、Pm2+Pm8+Pm21 2份(編號55、76)；⑤ 聚合4個基因的材料5份，其中，Pm2+Pm4a+Pm6+Pm8 2份(編號40、49)、Pm2+Pm4a+Pm8+Pm21 3份(編號70、71、80)。

泳道上方數字為材料編號，左方為分子量大小，箭頭指向為Pm21基因標記的特異條帶。M為DNA marker DL 100～2000 bp圖3 白粉病抗性基因Pm21標記在不同小麥種質中擴增Fig.3 Amplified result of the gene marker Pm21 resistant to powdery mildew in different wheat germplasma

成株期田間白粉病抗性鑒定表明(表5)，9個基因標記均未得以檢測的材料3份材料病級均為7～8級，為高感白粉病；Pm2、Pm4a和Pm8基因中不論是攜帶單個基因或兩、三個基因的材料，材料田間抗病性均表現為不同程度感病，病級大體上為5～8級，屬于MS-HS，唯有材料13為2～3級，為HR-MR，材料28、45為4～5級，屬于MR-MS；攜帶Pm6基因的材料大體上表現為抗病，病級為2～4級，屬于HR-MR，而材料27、42、46為4～5級，為HR-MS；攜帶Pm21基因(其親本均為南京農業大學細胞遺傳所創建的細胞學材料92R-)的材料，不論是單基因或與其他基因互作，病級為0～2級，均表現為I-HR。

表5 小麥種質資源中不同白粉病抗性基因標記及抗病性鑒定

續表5 Continued table 5

編號CodePm2Pm4aPm6Pm8Pm21病級Disease grade抗病性Resistance編號CodePm2Pm4aPm6Pm8Pm21病級Disease grade抗病性Resistance21++—+—5～6MS62++—+—4～5MR-MS22++—+—5～6MS63++——+1～2HR23+——+—6～7MS-HS64++——+0;-1NI-HR24++—+—5～6MS65++——+0;-1NI-HR25++—+—7～8HS66+———+1～2HR26++—+—6～7MS-HS67++——+0;NI27+—+——4～5MR-MS68++——+0;NI28++—+—4～5MR-MS69++——+0;NI29+—++—3～4MR70++—++0I30+—++—3～4MR71++—++0I31+—++—4～5MR-MS72++——+0;NI32+——+—6～7MS-HS73++——+0;NI33+—++—3～4MR74+———+0;NI34+—++—3～4MR75++——+0;NI35+——+—7～8HS76+——++0;NI36+————7～8HS77++——+0;NI37+——+—7～8HS78+————6～7MS-HS38+——+—6～7MS-HS79++———5～6HS39+——+—6～7MS-HS80++—++0I40++++—2～3HR-MR81+—+——3～4MR41+————7～8HS

3 討 論

作物遺傳改良的突破性進展與所需種質資源的發現、開拓及其利用密切相關[33]。當今栽培小麥的遺傳基礎日趨狹窄、脆弱，不能適應高產、穩產和可持續發展的需要，小麥種質資源遺傳多樣性是其遺傳改良的基礎，特異種質資源的篩選、鑒定及利用是拓寬小麥遺傳基礎、提高育種效率、選育優良品種的重要途徑。柴永峰等[34]對146份小麥種質的研究表明，產量、主莖穗長、穗粒數等性狀變異系數較大。王光祿等[35]對國外引進的94份小麥種質的主要農藝性狀變異系數分析發現，不孕小穗﹥有 效 穗 數﹥穗 粒 數﹥產量﹥株高﹥千粒重，其農藝性狀的變異系數都較大。 劉新月等[36]對小麥產量構成因素進行分析，發現產量相關程度以有效穗數(0.834)為最大。本試驗81份小麥種質的9個農藝性狀指標進行分析表明，平均變異系數為7.19 %，依次為有效穗(14.77 %)﹥穗粒重(14.41 %)﹥穗粒數(8.94 %)﹥穗下莖長(7.03 %)﹥結實數(5.69 %)﹥小穗數(5.03 %)﹥穗長(4.98 %)﹥株高(3.21 %)﹥千粒重(0.65 %)，說明這81份小麥種質的藝性狀上具有較大的變異潛力，這可能與材料親緣關系和地理差異較遠有關。同時，10項農藝性狀指標間相關分析表明，穗下莖長有利于增加有效穗、穗長、小穗數和結實數，而不利于千粒重、經濟系數和穗粒數的提高，說明穗下莖長對產量的直接貢獻不大；有效穗與穗粒數、經濟系數均呈極顯著負相關，說明過多的分蘗使得群體間競爭加大、生物學產量增加，不利于提高穗粒數和經濟系數，符合生產實際情況；穗長越長有利于小穗數、穗粒數的增多和提高粒重；小穗數和結實數越多，有利于提高單株粒數和粒重，而對整體產量的貢獻不大，具體原因需要進一步明確；穗粒數與穗粒重、穗粒重分別與千粒重和經濟系數、千粒重與經濟系數均呈極顯著正相關，說明粒數、粒重、千粒重、經濟系數對產量貢獻具有一致趨勢，也是符合生產實情。聚類分析方法在研究作物種質資源的起源、差異和分類已廣泛應用，通過對81份種質10項農藝性狀指標的聚類分析將材料分為7個類群，各類群間差異明顯。總體上，第Ⅰ類群多為一些古老地方品種，22份材料平均有效穗最多為(6.83±1.986)個；第Ⅱ類群基本上為一些育成品種，54份材料平均株高最矮為(83.94±13.429)cm，說明自矮稈和半矮稈基因在小麥育種中廣泛利用，極大地提高了小麥的抗倒伏性及其單位面積的產量水平[37-39]，育種應用時可作為改良株高的中間親本，所以，20世紀以來小麥品種的演變過程中，株高降低是一個顯著的特點[40]；其他類群均僅包括1份材料，部分農藝性狀表現突出，尤其第Ⅵ類群的提摩菲維小麥在穗長、穗粒數、穗粒重、千粒重、經濟系數等指標均存在明顯優勢，在改良小麥穗部特性或提高產量方面表現出一定潛力，因此育種上可作為豐產材料加以利用。由于未對其品質性狀進行分析，因此今后應對這些材料進行品質鑒定后，以篩選出綜合性狀較好的材料。

20世紀60 年代以來，隨著矮稈品種的推廣種植、氮肥施用量和種植密度增大，白粉病在世界主要麥區的危害日趨嚴重，也是我國小麥生產中最嚴重的病害之一。化學防治對小麥白粉病已取得一定的成效，但浪費人力、物力和財力，特別是會造成環境污染。因此，選育抗病品種是防治小麥白粉病最經濟、有效的方法[3]。充分利用已發現的抗小麥白粉病基因，同時積極拓寬小麥遺傳基礎，挖掘出更多的抗白粉病新種質(新基因)，是目前小麥育種工作者的當務之急。抗小麥白粉病基因主要來源于普通小麥本身及其近緣種屬，第一類來源于小麥屬，其中Pm1 (a-d)、Pm4 (d-j)、Pm9、Pm10、Pm11、Pm14、Pm15、Pm18、Pm22、Pm23、Pm24、Pm28和Pm29 等來源于普通小麥；另外，如Pm2來源于阿拉拉特小麥；Pm4a和Pm5 來源于栽培二粒小麥；Pm4b來源于波斯小麥；Pm6和Pm27來源于提莫菲維小麥；Pm16、Pm26和Pm30 來自于野生二粒小麥；Pm25來源于野生一粒小麥；Mld來源于硬粒小麥，等。第二類來源于小麥近緣種屬，包括Pm7、Pm8、Pm17和Pm20來源于栽培黑麥；Pm12來源于擬斯卑爾脫山羊草；Pm13來源于高大山羊草；Pm19來源于粗山羊草；Pm21來源于簇毛麥。這些抗性基因中，多數在染色體上有明確定位，如，Pm21、Pm31被定位于簇毛麥6VS[18,20,41]、Pm12在擬斯卑爾脫山羊草6S[42]、Pm20在栽培黑麥6RL[43]、Pm30在5BS[44]、MlZec1在2BL[45]、MllW72在7AL[46]、PmG3M在6BL[41]、Pm26和Pm47在2BS[11, 47]、Pm51在中間偃麥草漸滲系2BL[48]，等等。這些抗性基因在不同時期不同程度地提高了小麥抗白粉病的能力，尤其Pm21為表現出廣譜、高效、持久的抗性，已廣泛應用于國內小麥抗白粉病育種中。本試驗利用9個白粉病抗性基因標記檢測這些基因在81份小麥種質中的分布，其中，僅檢測Pm2、Pm8的材料分別為10份、1份，聚合Pm2+Pm4a、Pm2+Pm6、Pm2+Pm8、Pm2+Pm21基因的材料分別為4、4、13、2份，聚合Pm2+Pm4a+Pm8、Pm2+Pm4a+Pm21、Pm2+Pm6+Pm8、Pm2+Pm8+Pm21基因的材料分別為16、10、10、2份，聚合Pm2+Pm4a+Pm6+Pm8、Pm2+Pm4a+Pm8+Pm21的材料分別有2、3份。同時，對材料進行成株期田間白粉病抗性鑒定，表明9個基因標記均未得以檢測的材料4份材料病級均為6～8級感白粉病；Pm2、Pm4a和Pm8基因中不論是攜帶單個或多個基因聚合的材料田間抗病性均表現為不同程度感病，病級大體上為5～8級，屬于MS-HS；攜帶Pm6基因的材料大體上表現為抗病，病級為2～4級，屬于HR-MR；攜帶Pm21基因的材料，不論是單基因或與其他基因互作，病級大體在0～2級，表現為I-HR。但也有例外，材料13僅有Pm8基因標記得以檢測，而病級為2～3級高抗至中抗，這可能與該材料攜帶的Pm17、Pm20抗性基因有關[14-17]；而材料28和45分別有Pm2、Pm4、Pm8和Pm2、Pm8基因標記得以檢測，病級均為4～5級，屬于MR-MS，材料27、42、46中Pm2和Pm6基因標記得以檢測，病級為4～5級，為MR-MS，這可能與鑒定的植株數及所用抗性基因標記數量都偏少有關，今后抗病性分析中要擴大鑒定群體和增加基因標記數量。總體上，上述基因中Pm6、Pm21具有較好的抗白粉性，可以在抗病育種中加以利用，尤其Pm21抗性最強，抗譜最廣，是中國目前使用最廣泛的抗白粉病基因。