烤煙根系分泌物自毒效應研究

譚小兵，朱 媛，楊煥文，王 戈*，白羽祥，呂世保，程亞東

(1.云南農業大學煙草學院，云南 昆明 650201; 2.云南省農業科學院農業經濟與信息研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】烤煙是中國主要經濟作物之一，屬于茄科(Solanaceae)忌連作作物，但由于可用耕地面積有限和生態條件等因素，導致連作現象普遍存在。據統計，中國烤煙連作面積占烤煙總種植面積的30 %～60 %，經濟損失嚴重[1]。長時間連作會造成土壤有毒物質積累，理化性狀惡化，同時微生物結構失衡，且煙葉產質量降低，病蟲害發生率顯著增加[2-4]，嚴重制約了中國煙葉生產的可持續發展?！厩叭搜芯窟M展】自毒作用(autotoxicity)是植物根分泌和殘茬降解時釋放出的次生代謝物對其自身或種內植物產生危害的一種現象[5]，許多作物連作障礙與此密切相關[6]。目前，國內外已有不少有關根系分泌物與連作障礙關系的研究報道。相關研究表明，根系分泌物會顯著抑制烤煙幼苗的生長發育及其生理代謝過程[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c】至今有關烤煙根系分泌物與烤煙產生連作障礙方面的研究甚少，更沒有對根系分泌物自毒物質進行分離鑒定?！緮M解決問題】本試驗在水培條件下提取烤煙根系分泌物，通過外源添加模擬連作條件，研究根系分泌物對自身種子萌發和幼苗生理指標的影響，旨在探討烤煙根系分泌物對連作障礙的影響，為豐富烤煙連作障礙機理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為烤煙主栽品種紅花大金元(以下簡稱紅大)，供試種子為裸種，由南方育種中心提供，將紅大種子用2 %的硫酸銅消毒15 min，催芽后播于育苗盤上，采用常規烤煙漂浮育苗。

1.2 根系分泌物收集

根系分泌物收集在云南農業大學化學樓完成。采用水培法收集，具體步驟為：紅大幼苗(4葉1心)時進行營養培養試驗，營養液采用Hogland營養液和Amon微量元素營養液，培養液以淹沒根部為度，每天加去離子水至規定刻度，定時通氧；每3 d測1次pH，調整pH至6.0±0.2，每周更換1次營養液。營養液培養兩周后收集根系分泌物，將煙苗從營養液中取出，去離子水沖洗干凈后，將煙苗放入用錫箔紙包裹的盛有無菌去離子水的三角瓶中培養(原光條件下)，每天收集6 h(9:00-15:00)，連續收集5 d，合并收集液后制成濃度為1.00 g/mL(表示1 mL水溶液中含有1.0 g植物鮮重的根系分泌物)根系分泌物母液，加入幾滴5 mg/L百里酚溶液后密封置入-20 ℃低溫下冷藏備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 將4葉1心煙苗移入塑料盆缽(9.5 cm×9.0 cm×11.5 cm)培養，基質為煙草專用育苗基質，每盆定植3株，向內添加200 mL營養液(Ca(NO3)2·4H2O 1.18 g/L，KNO30.51 g/L，MgSO4·7 H2O 0.49 g/L，KH2PO40.14 g/L)，第5葉完全展開時一次性添加不同濃度根系分泌物水溶液50 mL，濃度梯度為0(CK)、0.25、0.50和1.00 g/mL，3次重復，每天每盆定量添加20 mL蒸餾水，培養20 d后采集幼苗葉片和根系測定相關指標。

1.3.2 指標測定及方法 ①根系分泌物對種子萌發的影響:準確吸取3個濃度的根系分泌物10 mL加入到鋪有濾紙的培養皿內，每個培養皿整齊排入50粒紅大種子(裸種)，每處理3個重復，26 ℃下光照培養箱中黑暗培養14 d后調查發芽率。②根系分泌物對幼苗生長和生理指標的影響。生物性狀及總葉綠素測定：取樣后立即測量各處理株高和根長，用吸水紙吸干后測量地上和地下部分鮮重。用日產SPAD-502測定煙苗葉片總葉綠素含量的相對值。每個處理測定3株。根系活力、pH值及相對電導率測定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[10]測定紅大根系活力，pH值采用PHS-2C酸度計測定，用電導率儀(上海雷磁儀器廠)測定煙苗的相對電導率。氧化酶活性測定：SOD、POD和CAT活性測定參考李合生[10]的方法。SOD活性采用NBT-還原法，POD酶活性采用愈創木酚法，CAT以每分鐘減少0.01為一個酶活力單位(U/g·min FW)，通過測定OD532、OD600和OD450值，按公式C(μmol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450計算MDA含量。

1.4 數據處理和統計方法

實驗數據采用Excel 2010和SPSS 19.0進行處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對紅大自身種子發芽率和幼苗生長的影響

從表1可見，紅大根系分泌物會顯著降低紅大種子發芽率和各項生物性狀指標。隨著分泌物濃度的增加種子發芽率顯著降低，表現為1.00 g/mL<0.50 g/mL<0.25 g/mL

表1 不同處理對紅大種子發芽率和幼苗生長的影響

注：數據為平均數±標準差，n=3。表中同列不同小寫字母表示不同處理之間差異達到顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: The data are means ± standard deviation,n=3. Different lowercases in the same column indicate significant difference in different treatments at 5 % level. The same as below.

2.2 不同處理對紅大幼苗生理特性的影響

2.2.1 對葉綠素總量(SPAD)的影響 隨根系分泌物濃度增加紅大幼苗總葉綠素含量顯著降低(圖1)，濃度為0.50 g/mL和1.00 g/mL較CK幼苗葉綠素含量分別顯著降低了39.18 %和54.64 %；低濃度(0.25 g/mL)幼苗葉綠素含量較CK降低4.42 %，兩者差異未達到顯著水平。表明根系分泌物會抑制葉內葉綠素合成，從而降低植株光合速率，進而影響煙株物質合成。

2.2.2 對根系活力的影響 從圖2可見，根系分泌物對紅大幼苗根系活力具有顯著的抑制作用，且各處理濃度間達到了顯著水平。幼苗根系活力隨著根系分泌物濃度的增加逐漸下降，表現為CK>0.25g/mL>0.50 g/mL>1.00 g/mL，其中在低濃度(0.25 g/mL)時根系活力237.81 μg/h,FW較CK 266.09 μg/h,FW顯著降低了10.63 %，降幅最??；高濃度(1.00 g/mL)時根系活力為75.59 μg/h,FW相比CK降幅最大為71.59 %。說明根系分泌物中自毒物質嚴重抑制了根系的生長發育。

數據為平均數±標準差，n=3。不同小寫字母表示不同濃度處理間差異顯著(P<0.05)，下同The date are means ± standard deviation of three replicates. Different small letters indicate significant different among treatments(P<0.05), the same as below圖1 不同處理對紅大幼苗總葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of different treatments on Chl content(SPAD)

圖2 不同處理對紅大幼苗根系活力的影響Fig.2 Effect of different treatments on root activity

2.2.3 對葉片和根際pH值的影響 不同的根系分泌物濃度對紅大幼苗葉片和根際pH影響顯著(圖3)。表現為隨著根際分泌物濃度的增加紅大根際pH逐漸降低。同時隨著分泌物濃度的增加幼苗葉片的pH值表現出先降低后上升的趨勢，在濃度為0.50 g/mL時達到最小，且3個濃度處理均顯著低于CK，分別較CK降低4.26 %、8.34 %、5.40 %。

2.2.4 對紅大葉片和根系電導率的影響從圖4可見，各處理之間葉片和根系導電率均表現為1.00 g/mL>0.50 g/mL>0.25 g/mL>CK。其中葉片相對電導率較CK分別提高4.24 %、6.59 %和8.69 %，根系相對導電率較CK分別提高8.11 %、16.33 %和19.23 %，且各處理之間差異顯著。表明烤煙根系分泌物中存在某些化學物質使細胞膜透性受到破壞，濃度越高破壞程度越大。

2.3 不同處理對紅大幼苗保護酶活性和膜脂過氧化物的影響

2.3.1 對POD活性的影響 根系分泌物對紅大幼苗內POD活性存在不同程度的影響(圖5)。葉片POD活性表現為1.00 g/mL>0.50 g/mL>0.25 g/mL>CK，呈現出隨著處理濃度的增加而增加的趨勢，其中高濃度(1.00 g/mL)較CK顯著提高57.04 %，且與0.50 g/mL與0.25 g/mL也達到顯著水平；幼苗根系POD活性隨根系分泌物濃度增加呈現先增后降的趨勢，在0.5 g/mL時達到最大值，較CK提高35.71 %，同時低濃度(0.25 g/mL)和高濃度(1.00 g/mL)較CK也分別提高了19.55 %、7.30 %。說明根系分泌物會導致煙苗體內活性氧水平增加，從而誘導POD活性的提高。

圖3 不同處理對紅大幼苗葉片和根際pH值的影響Fig.3 Effect of different treatments on pH value in leaves and rhizosphere

圖4 不同處理對紅大幼苗葉片和根系相對電導率的影響Fig.4 Effect of different treatments on relative conductivity in leaves and root

圖5 不同處理對紅大幼苗葉片和根系POD活性的影響Fig.5 Effect of different treatments on POD activity in leaves and root

2.3.2 對紅大SOD活性的影響 從圖6可見，隨根系分泌物濃度增加幼苗葉片和根系SOD活性表現為先增后降的趨勢。幼苗根系SOD活性在0.25 g/mL時最高為144.83 U/g·min,FW，顯著高于其他處理，且在高濃度1.00 g/mL時活性最低為126.12 U/g·min,FW，顯著低于其他處理，與CK相比下降7.31 %。幼苗葉片SOD活性在0.50 g/mL是最高，表現為0.50 g/mL>1.00 g/mL>0.25 g/mL>CK，且各濃度處理SOD活性均顯著高于CK，進一步證明根系分泌物會對抗氧化酶系統產生破壞，誘導了SOD活性的升高。

2.3.3 對紅大CAT活性的影響 從圖7可見，隨著根系分泌物濃度的增加，紅大幼苗葉片和根系CAT活性呈先增加后降低的趨勢。2者均在作用濃度超過0.25 g/mL后開始下降，在1.00 g/mL達到最低。低濃度(0.25 g/mL)處理根系和葉片中CAT活性顯著高于其他處理，說明自毒物質含量較低時誘導煙株體內CAT活性增加以降低自毒物質傷害；但隨處理作用濃度增加，根系和葉片中CAT活性顯著降低，其中高濃度(1.00 g/mL)處理與CK相比根系中CAT活性顯著下降24.85 %，葉片中CAT活性顯著下降7.55 %，說明隨著濃度的增加，烤煙幼苗對根系分泌物中的自毒物質耐受力降低。

圖6 不同處理對紅大葉片和根系SOD活性的影響Fig.6 Effect of different treatments on SOD activity in leaves and root

圖7 不同處理對紅大幼苗葉片和根系CAT活性的影響Fig.7 Effect of different treatments on CAT activity in leaves and root of tobacco

2.3.4 對紅大MDA含量的影響 從圖8可見，隨著根系分泌物濃度增加紅大幼苗葉片和根系MDA含量逐漸升高。高濃度(1.00 g/mL)處理與CK相比葉片中MDA含量增加39.34 %，且顯著高于0.25和0.50 g/mL處理，同時高濃度(1.00 g/mL)處理與CK相比根系中MDA含量增加65.69 %，兩者差異顯著，且1.00與0.25 g/mL處理之間差異也達到顯著水平。說明根系分泌物導致膜脂過氧化程度加劇，膜系統受到嚴重損傷，植株抗逆性降低。

3 討 論

植物產生連作障礙是植物與土壤環境共同作用的結果。其中植物化感自毒作用是連作障礙發生的一個重要原因，而自毒作用主要依賴于植物根系分泌物質到環境中抑制植物生長[11]。據相關研究報道，根系分泌物中的自毒物質通過影響土壤理化性狀、土壤微生物結構、細胞膜透性、抗氧化酶系統、營養狀況以及病蟲害發生率等多方面來抑制植物的生長發育[12-13]。

圖8 不同處理對紅大葉片和根系MDA的影響Fig.8 Effect of different treatments on MDA content in leaves and root of tobacco

本試驗結果表明，紅大根系分泌物會顯著抑制紅大種子發芽率、株高、根長、地上部分以及地下部分鮮重，表現在隨著根系分泌物濃度的增加抑制作用增加，在高濃度(1.00 g/mL)表現出明顯的抑制作用，這與前人研究結果一致[14]。表明了烤煙根系分泌物中存在抑制自身種子萌發和生長發育的有毒物質。同時這種抑制作用在根長、地上以及地下部分鮮重上表現極為明顯，可能原因是根系是與自毒物質直接接觸的器官，從而影響植株對養分和水分的吸收，導致生長發育受阻。有研究表明根系較其他器官對自毒物質的響應更加敏感[15]。本研究結果中，根系分泌物會顯著降低幼苗總葉綠素含量、根系活力以及煙株的pH。說明根系分泌物會導致煙株光合能力降低，破壞細胞膜通透性，加大離子滲透量以及使根系還原能力下降。相關研究結果表明，根系分泌物中有機酸以及酚酸類物質會抑制煙株光合作用，降低葉綠素含量以及根系長度[16-20]，這與本研究結果一致。SOD、POD和CAT活性是植株內抗氧化酶系統的重要組成部分，對于植株抗逆性系統穩定性具有重要作用。本試驗結果表明，根系分泌物會破壞幼苗體內抗氧化酶系統。表現為幼苗內SOD、POD和CAT活性的增加以降低自毒物質對煙苗抗氧化酶系統的破壞。除幼苗葉片POD活性隨著處理濃度增加而增加外，其他SOD、POD和CAT活性均隨著處理濃度的增加呈現出先升高后降低的趨勢，這是因為隨著根系分泌物濃度增大，使得自毒物質也隨之增加，導致幼苗體內抗氧化酶系統遭受破壞，抗逆性性降低，使得酶活性受到抑制，且不同的酶對這種毒害作用的耐受力不同，進而導致各種酶活性降低時的根系分泌物作用濃度不同[12]。同時，根系分泌物也會導致煙苗體內MDA含量增加。這也進一步說明植株抗氧化酶系統受到嚴重破壞。相似的研究結果也有過報道[21-22]。

4 結 論

在烤煙根系分泌物中的確存在自毒物質，并且會隨著此類物質的濃度以及含量的變化而產生不同的自毒效應。表現為種子發芽率、煙苗素質、光合作用等受到抑制、抗氧化酶系統受到嚴重破壞，從而導致烤煙生理代謝受到破壞，進而影響煙株生長發育。這也可以在一定程度上解釋隨著烤煙連作年限的增加，土壤中有毒物質不斷累積，導致烤煙產質量大幅降低，病蟲害急劇增加等現象。為進一步弄清烤煙連作障礙機理，還有必要對根系分泌物種類和含量進行定性定量分析，以確定自毒物質種類及致毒含量。