利用SCoT檢測菜心F2分離群體的遺傳多樣性

羅海玲，史衛東*，康紅衛，張 力，熊發前，農貴雄

(1. 廣西農業科學院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007；2. 廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西 南寧 530007；3. 廣西農業科學院經濟作物研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】菜心(BrassicaCampestrisL.ssp.chinensisVar.utilisTsen et Le)是兩廣著名特產蔬菜，種植和生產區域主要為華南地區，現已引種到寧夏、甘肅、河南、云南及江西等省(自治區)，種植面積逐漸加大。菜心品種繁多，但仍然以常規種為主。菜心遺傳多樣性水平較低，親緣關系較近[1]，常用育種方法是系統選育和雜交法，僅利用表型鑒定篩選具有周期長和效率低等問題。F2分離群體后代是雜交育種的常用材料，開展菜心F2群體后代的遺傳多樣性分析，可以彌補表型鑒定的不足，提高篩選和鑒定效率；快速鑒定F2∶3家系間的優異單株，對高抗優質菜心品種選育效率的提高也同樣具有重要意義。【前人研究進展】利用ISSR標記檢測表明菜心品種的遺傳背景狹窄[4]，利用RAPD標記可以檢測出菜心品種間不同程度的遺傳差異，并根據遺傳距離和相似系數確定品種間的親緣關系[2-3]，利用AFLP和SCoT標記檢測表明菜心遺傳多樣性程度較低，遺傳變異主要來源于種內[5-10]。SCoT標記的多態性來源于植物基因翻譯起始序列ATG及其側翼序列[11]，偏向候選功能基因區，容易與目標性狀關聯[11-12]，結合了ISSR標記和 RAPD標記的優點，在植物遺傳多樣性研究中廣泛應用[13-14]。【本研究切入點】前人利用分子標記在作物親緣關系鑒定中進行了大量研究，但利用SCoT標記檢測菜心F2分離群體遺傳多樣性方面的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】以菜心抗小菜蛾品種Caixin65和感小菜蛾品種Caixin69及其雜交后代所得的54份F2分離群體家系為實驗材料，利用SCoT標記檢測遺傳多樣性，為高抗優質菜心新品種的選育和分子標記輔助育種提供理論基礎和基礎材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣西農業科學院蔬菜研究所菜心抗小菜蛾品種Caixin65和感小菜蛾品種Caixin69的雜交F2分離群體得到的54份F2∶3家系及2個親本為實驗材料，按家系種植，常規田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用改良的CTAB法提取基因組總DNA[15]。

1.2.2 SCoT分析 優化后的PCR體系20.0 μl：1.5 mmol/L MgCl2、0.5 μmol/L引物、0.5 mmol/L dNTPs、1.25 UTaqDNA聚合酶、50 ng基因組DNA。PCR程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共35個循環；72 ℃最后延伸5 min。PCR產物經1.5 %瓊脂糖膠電泳(1×TAE buffer)和溴化乙錠染色后，在紫外凝膠成像系統上拍照保存。17條引物序列如下：

S1：CAACAATGGCTACCACCA；S2：CAACAATGGCTACCACCC；

S4：CAACAATGGCTACCACCT；S5：CAACAATGGCTACCACGA；

S6：CAACAATGGCTACCACGC；S11：AAGCAATGGCTACCACCA；

S13：ACGACATGGCGACCATCG；S14：ACGACATGGCGACCACGC；

S18：ACCATGGCTACCACCGCC；S19：ACCATGGCTACCACCGGC；

S20：ACCATGGCTACCACCGCG；S22：AACCATGGCTACCACCAC；

S29：CCATGGCTACCACCGGCC；S30：CCATGGCTACCACCGGCG；

S31：CCATGGCTACCACCGCCT；S33：CCATGGCTACCACCGCAG；

S34：ACCATGGCTACCACCGCA。

1.3 統計分析

將瓊脂糖凝膠板的每一條SCoT擴增產物視為1 個位點，有帶記為1，無帶記為0，建立各個SCoT 引物在各個樣品種的擴增分布表，利用GenAlEx 6.0軟件計算遺傳多樣性分析，并用不加權成對算術平均法(unweightpair-group method using arithmetic averages, UPGMA) 進行聚類分析。將F2∶3家系的抗蟲分級默認為與菜心F2群體的相同[15]，并作為表型性狀與SCoT標記得到的Nei遺傳距離矩陣做mantel測試，以檢驗抗蟲表型與分子標記多態性的相關性。

2 結果與分析

2.1 56份菜心的SCoT多態性

由表1可知，17對引物共擴增出條帶161條，其中多態性條帶共61條，多態性百分率為38.80 %；平均每條引物擴增出條帶9條，其中多態性條帶4條。片段大小為500～1500 bp。結果表明，每條引物能夠鑒定出54份材料的遺傳差異，但引物檢測效率相差很大，多態性豐富的引物檢測的遺傳多樣性也豐富(圖1)。

2.2 56份菜心的遺傳多樣性

由表2可知，56份菜心的遺傳多樣性指數變化范圍均發生于母本69與Pop21家系之間，多態性位點百分率變幅為24.24 %～66.67 %，平均值為45.02 %，觀察等位基因數(Na)變幅為0.6212～1.4697，平均值為1.1613；有效等位基因數(Ne)變幅為1.1714～1.4714，平均值為1.3184；Shannon多樣性指數(I)變幅為0.0147～0.4031，平均值為0.2723；期望雜合度(He)變幅為0.1004～0.2761，平均值為0.1865。Nei遺傳距離平均值為0.225，最大值0.586(Pop26～Pop59)，最小值0.001(Pop9～Pop14)，表明多數家系的分子遺傳距離相近，家系間的遺傳多樣性較低，但少數家系之間已經發生了遺傳多樣性變化。

表1 17條ScoT引物擴增結果

在Nei遺傳距離0.080之處，可以將56份菜心分為5類。第1類包括40個家系，分別是Pop3～Pop4、Pop6～Pop9、Pop11～Pop14、Pop16～Pop17、Pop23～Pop29、Pop31、Pop33～Pop35、Pop37～Pop38和Pop40～Pop54。第2類包括8個家系，分別是Pop1、Pop2、Pop10、Pop19、Pop20、Pop21、Pop32和Pop39。第3類包括4個家系和2個親本，分別是母本69、父本65、Pop5、Pop15、Pop22和Pop30。第4類包括1個家系，即Pop36。第5類包括1個家系，即Pop18。第1類的40個家系表明SCoT標記未檢測出多數家系間的顯著基因組變化，可能是由于大部分家系之間尚未發生顯著分離；而第2、3、4和5類的家系可能發生了基因組變化，因而呈現出SCoT多態性。聚類分析結果(圖2)也表明少數家系可以繼續用于優異家系選育。

2.3 菜心遺傳多樣性的抗蟲性評價

除SCoT多態性外，抗蟲性也是評價此群體的重要指標。利用SCoT分子標記得到的Nei遺傳距離與F2∶3家系的抗蟲系數進行mantel測試，結果表明兩者相關不顯著(圖3)，R2=-0.007(P=0.6)，這說明家系的抗蟲性基因已發生重組，表型性狀有所改變，SCoT分子標記未能反映F2∶3家系的抗蟲性差異，其抗蟲性水平可能需要在高世代繼續鑒定，才能選擇出優異的家系。

M：DL2000 DNA 標記；1～56：56份菜心樣本 M: DL2000 DNA marker; 1-56: 56 Chinese flowering cabbage samples圖1 ScoT 20引物對56份菜心基因組DNA的PCR擴增結果Fig.1 The SCoT amplification profile of 56 Chinese flowering cabbage samples with primer SCoT 20

表2 56份菜心的SCoT遺傳多樣性信息

續表2 Continued table 2

編號Number多態性位點百分率(%)Percentage of polymorphic loci觀察等位基因數(Na)Observed number of alleles有效等位基因數(Ne)Effective number of allelesShannon多樣性指數(I)Shannon's information index期望雜合度(He)Expected heterozygosity Pop4653.031.2424 1.3750 0.3207 0.2197 Pop4740.911.1667 1.2893 0.2474 0.1695 Pop4836.360.8485 1.2571 0.2199 0.1506 Pop4943.941.2121 1.3107 0.2657 0.1820 Pop5037.881.1515 1.2678 0.2291 0.1569 Pop5139.391.1212 1.2786 0.2382 0.1632 Pop5242.421.1818 1.3000 0.2565 0.1757 Pop5339.391.1061 1.2786 0.2382 0.1632 Pop5443.941.1515 1.3107 0.2657 0.1820 均值Average45.021.1613 1.3184 0.2723 0.1865

圖2 56份菜心的UPGMA聚類分析結果Fig.2 Dendrogram for 56 Chinese flowering cabbage samples based on UPGMA analysis

圖3 56份菜心遺傳多樣性與抗蟲相關性分析Fig.3 Correlation analysis of 56 Chinese flowering cabbage samples between genetic diversity and insect-resistance

3 討 論

SCoT標記目前廣泛應用于菜心[10]、水稻[11]、芒果[13, 16]、馬鈴薯[14]、葡萄[17]、蘭[18]、柿[19-20]、芥藍[21]、枇杷[22]及煙草[23]等數10種作物的遺傳多樣性分析與親緣關系的鑒定，結果表明：SCoT 分子標記在芒果遺傳多樣性和親緣關系研究中是一種非常有效的分子標記[12]，不僅適用于不同品種的葡萄、不同生態地理分布的芒果及不同倍性的枇杷等果樹的遺傳多樣性等的研究，也適用于芥藍、菜心等蔬菜親緣關系的鑒定，這表明SCoT標記在種質資源遺傳多樣性和親緣關系的鑒定方面是一種高效可信的技術。

研究也表明SCoT引物不適于對普通煙草種內不同類型的遺傳分析，可用于煙草種間的遺傳關系的分析及遠緣雜種的鑒定[23]。本研究選用17對SCoT引物從56份菜心F2分離群體中共擴增出161個條帶，多態性百分率為38.8 %，與史衛東等[10]報道的33份菜心SCoT的平均多態性相當，低于王麗[2]、譚雪等[3]和張金艷等[24]的RAPD檢測結果，也低于具有部分相同菜心品種的AFLP檢測結果[9]。本研究中，SCoT多態性條帶共61條，平均每條引物擴增出條帶9條，其中多態性條帶平均為4條，低于Shi等[9]的AFLP多態性研究結果。這表明菜心家系間的SCoT多態性變化范圍較大，所以引物檢測效率仍然是提高SCoT標記檢測效率的關鍵，SCoT標記是單引物標記，多態性高的引物檢測的遺傳多樣性水平也較高[10]。本研究結果表明，除了能夠用于菜心品種不同生態型的遺傳多樣性分析[10]，SCoT標記也可以初步用于大量家系間的批量檢測，從而擴大了其在育種中的應用范圍。

F2群體是雜交育種常用的臨時性分離群體，重復性差，隨機偏差大，性狀聚合時間較長且容易丟失[25]。本研究以抗/感蟲品種雜交后代得到的F2∶3家系及其親本為實驗材料進行SCoT聚類分析，結果發現多數家系歸為一類，意味著這些家系間還未發生顯著的基因組變化，但少數家系發生了基因組變化。SCoTNei遺傳距離與F2∶3家系抗蟲系數的mantel測試表明兩者相關不顯著，但從株高、開展度、葉片數、主薹高度和主苔粗度等性狀表現來看，SCoT聚類結果較明顯：株高和主薹高度均顯著增大，其中株高從31.2 cm升高至45.4 cm，主薹高度從30.0 cm升高至44.8 cm，主薹直徑逐漸變大(從1.3 cm增至1.8 cm)，葉片數增多(從19.3片增至28.4 片)，抗蟲指數升高(從0.5255升高至0.71)；但每一類又稍有不同：第2類的抗蟲指數最低(0.5255)，第3類的葉片數和主薹直徑變化與第1類接近，都比較低，第5類的其他性狀值都較高但開展度較低。這意味著F2∶3家系可能在基因組水平上確實發生了不同程度的分離和重組，包括ATG 翻譯起始位點及其側翼區域編碼序列的染色體重組，或者包含抗蟲相關基因片段的染色體重組，通過不同性狀的基因組位點變化，呈現跟蹤性狀的SCoT多態性和抗蟲相關性狀的變異。因此，利用SCoT標記檢測F2分離群體的遺傳多樣性水平，結合表型及抗性篩選，可以加快純化育種進程，獲得廣泛分離的育種資源，提高育種效率。SCoT標記能跟蹤性狀并與檢測分離群體的遺傳多樣性水平在花生異源多倍化過程中也得到證明，花生SCoT 產物在 F1基因組即開始發生變化，在分離后代中丟失的親本條帶以父本條帶為主[26]。

本研究中2個親本(65和69)歸為一類的原因可能與種質資源狹窄有關[9]，菜心起源和生產區域主要在華南地區，品種交流頻繁，因而造成親緣關系較近，親本歸為一類，而且抗蟲性是數量性狀，抗/感蟲品種雜交獲得的F2群體和高世代的抗性水平較高但較不穩定[27]，在白菜抗蟲育種利用F2群體并進行早世代選擇可以提高育種效率[28-29]。前期研究結果表明菜心抗蟲親本、感蟲親本及F2代分離群體后代出現了明顯的分離，菜心對小菜蛾的抗蟲性可能是由顯性單基因控制的，12個抗蟲EST-SSR標記中的7個標記卡方測驗顯著，意味著可能與抗蟲性有關[15]。本研究利用54份F2∶3家系及2個親本進行SCoT分析發現僅有少數家系發生了基因組變化，雖然SCoT多態性與抗蟲性相關不顯著，但從綜合性狀來看SCoT能夠檢測出家系和性狀間的遺傳多樣性，因此結合表型及抗性篩選，可以加快純化進程，獲得廣泛分離的育種資源，提高育種效率。

4 結 論

SCoT標記具有操作簡單、重復性高、多態性較豐富等優點，通過SCoT檢測表明大部分菜心家系間遺傳距離接近，但少數家系間已經發生了分離，將ScoT標記用于菜心家系的遺傳多樣性檢測，結合表型篩選將有助于品種選育效率的提高。