Lasiodiplodia theobromae激活芒果防御酶基因差異表達的研究

康 浩，蘇初連，梅志棟，楊石有，劉曉妹，蒲金基，張 賀*

(1.海南大學熱帶農林學院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南 海口 571101；3.澄邁縣農業局，海南 澄邁 571900)

Lasiodiplodiatheobromae是發生在熱帶和亞熱帶地區常見的一種病原真菌[1]。芒果蒂腐病是芒果采后的主要病害，也是世界芒果主產區的主要病害之一。可可球二孢蒂腐菌(Lasiodiplodiatheobromae)在幼果期侵入并潛伏于果實中，潛伏期長，擴展迅速，常溫下3～5 d即可導致整個果實腐爛[2]，儲藏期病果率一般為10 %～40 %，發病嚴重時可達100 %[3]，在我國芒果主產區內普遍發生。【研究意義】寄主植物被病原菌侵染時能夠激活自身抗病防御酶基因高效表達，從而抵抗病原菌的侵染，提高其抗病性，有助于病害的有效管理。【前人研究進展】采后熱處理對芒果蒂腐病的控制效果不太穩定[4]，異菌脲、咪鮮胺等化學藥劑處理對該病有一定控制效果，但易產生農藥殘留、藥害和抗藥性等問題，該病成為影響芒果經濟效益的重要因素之一[2]。有關于抗性產生的生理生化機理的研究也很多，如苯丙氨酸解氨酶PAL參與木質素和植保素的合成，降低真菌、細菌侵入時分泌的果膠酶、β-1,3葡聚糖酶的活性，增加植物細胞壁厚度，增加植物自身的抗病性[5]；Sticher[6]認為過氧化物酶POD和多酚氧化酶PPO活性的提高可以作為抗性產生的生理生化標志[7]。超氧化物歧化酶SOD主要通過清除植物體內由于各種脅迫或傷害引起的過多自由基，減輕活性氧對寄主細胞膜脂的損傷及對細胞的破壞作用。因此，這些酶活性增強對植物的抗病反應有著十分重要的作用[8]。本實驗室中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶果樹病害研究組前期研究發現誘抗劑BTH處理芒果葉片后可以明顯提高各類酶的活性。【本研究切入點】本文選用芒果蒂腐菌的分生孢子分別接種芒果葉片和果實，定時取樣，通過實時熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)技術分析了7個防御酶相關基因的表達，再結合熱度圖綜合評價了病原菌侵染所誘導的防御酶基因的表達情況。【擬解決的關鍵問題】本研究通過抗病相關防御酶基因的差異性表達以期增強寄主植物對病原菌的抵抗能力，減緩病原菌在寄主植物內的擴展，并為了解病原菌與寄主之間的相互作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：貴妃芒的嫩葉和成熟果采自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家芒果種質資源圃內。

試劑：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自天根生化科技有限公司；DNA Marker DL 5000為大連寶生物工程有限公司產品，熒光定量試劑盒UltraSYBR Mixture (Low Roe)購自康為試劑公司；其它常用試劑均為常規分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 芒果組織總RNA的提取和cDNA第一鏈的反轉錄 供試材料為膠孢炭疽菌分生孢子(濃度為1.0 ×106個/mL)侵染貴妃芒嫩葉和果皮的組織，于不同時間點(0，12，24，36，48，72 hpi)取樣，提取不同時間點組織的總RNA并反轉錄成cDNA第一鏈，將反轉錄后的cDNA稀釋10倍，備用。

貴妃芒果實和葉片總RNA的提取參照天根生化科技公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒中的方法。提取各組織的總RNA后，用超微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000C型)并結合2 %的瓊脂糖凝膠電泳，測定提取RNA的OD，估算RNA濃度，-80 ℃保存作為后續研究。第一鏈cDNA的合成是按照天根公司的FastQuant RT Kit(with gDNase)試劑盒的方法，供試各個樣品反轉錄的總RNA的量統一為0.5 μg。

1.2.2 實時熒光定量PCR 以芒果超氧化物歧化酶 (MiSOD) 、多酚氧化酶(MiPPO) 、過氧化物酶(MiPOD)、幾丁質酶(MiCHI)、病程相關蛋白1(MiPR1)、苯丙氨酸解氨酶 (MiPAL)、生長素反應因子(MiARF)等抗病防御酶基因為對象，內參基因為芒果18 S(Mi18S)，通過實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)分析抗病防御酶基因在Lasiodiplodiatheobromae分生孢子侵染貴妃芒嫩葉、果實時的表達量。所用基因引物序列均由北京華大基因合成，PAGE純化。

表1 供試引物序列

采用Quant Studio 6 Flex實時熒光定量PCR檢測系統，每個PCR反應體系為20 μl：2× Mix 10 μl，cDNA 1 μl，上下游引物各0.5 μl，ddH2O 8 μl，每個樣本重復4次。

PCR反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；50 ℃保存，在72 ℃時收集熒光信號。

1.2.3 數據分析 通過實時熒光定量PCR儀自帶軟件(QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System Software)獲得各個樣品的Ct值，以0 h的表達量為對照，運用2-△△Ct法進行數據統計，并對數據采用鄧肯新復極差法進行方差分析[9]。

參照Deng[10]等人的方法，運用HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖，綜合分析各防御酶相關基因在不同時間點、不同組織內的表達差異。

2 結果與分析

2.1 Lasiodiplodia theobromae侵染芒果果實時防御酶相關基因表達量分析

通過qRT-PCR分析抗病防御酶基因在Lasiodiplodiatheobromae分生孢子侵染貴妃芒果實時的表達量，果實中7個芒果防御酶基因中活性氧相關基因(MiPOD、MiPPO)的表達量在各個時間段均差異顯著，活性氧相關的3個防御酶基因(MiPOD、MiPPO、MiSOD)表達量在36 h達到最大值，但MiPOD、MiPPO在6、12、24、48、72 h的表達量均低于0 h，MiPPO、MiSOD在6、12、24 h這3個時間點表達量的變化趨勢沒有MiPOD的變化趨勢快(圖1)；抗病相關的4個基因(MiCHI，MiARF，MiPR1和MiPAL)表達量的變化趨勢與活性氧相關的基因較為相似，也在36 h時表達量達到最大值(圖2)，但MiPR1整體呈先上升后下降的趨勢，36 h后的表達量顯著低于0 h的表達量，MiCHI，MiPAL在6和12 h時的表達量與0 h無顯著差異。

圖1 芒果果實3個活性氧相關基因在不同時間點的表達Fig.1 Expression of 3 active oxygen related genes in mango fruits at different time points

圖2 芒果果實4個抗性相關基因在不同時間點的表達分析Fig.2 Expression analysis of 4 resistance-related genes in mango fruits at different time points

通過HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖3顯示，Lasiodiplodiatheobromae分生孢子在侵染芒果果皮時能夠明顯激活7個防御酶相關基因的表達，部分基因在一些時間點高表達；接種36 h 時，7個基因均高效表達，明顯高于后續的時間點。MiPR1基因在整個侵染過程中均持續性地高表達，36 h時仍為最高表達量，而MiPOD基因除在36 h時表達量較0 h時高，其他時間點的表達量均較0 h時偏低。

2.2 Lasiodiplodia theobromae侵染芒果葉片時防御酶相關基因表達量分析

葉片中，7個芒果防御酶基因中活性氧相關基因(MiPOD、MiPPO)的表達量在各個時間點差異顯著，活性氧相關的3個基因(MiPOD、MiPPO、MiSOD)表達量在24 h達到最大值，其中MiPOD、MiPPO在各個時間點的表達量均較0 h的高，MiSOD除12、24 h表達量較0 h顯著增高，其他時間點表達量不顯著；抗病相關的4個基因(MiCHI，MiARF，MiPR1和MiPAL)表達量差異顯著，且變化趨勢較活性氧相關基因大。4個基因中除MiARF外其他3個均為正調控表達，MiARF表達量呈逐漸下降趨勢，MiPR1基因的表達量72 h時最大，MiCHI基因的表達量48 h最大(圖4～5)。

圖3 芒果果實7個防御相關基因在不同時間點的表達圖譜分析Fig.3 Expression patterns of 7 defense-related genes in mango fruits at different time points

圖4 芒果葉片3種活性氧相關基因在不同時間表達分析Fig.4 Expression of 3 active oxygen related genes in mango leaves at different time points

圖5 芒果葉片4種抗性相關基因在不同時間表達分析Fig.5 Expression analysis of 4 resistance-related genes in mango leaves at different time points

通過HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖6顯示，Lasiodiplodiatheobromae分生孢子在侵染芒果果皮時能夠明顯激活7個防御酶相關基因的表達，部分基因在一些時間點高表達；除基因MiSOD在6 h、MiARF在48、72 h時出現負調控表達其他基因在整個時間段均為正調控表達。基因MiPOD和MiPPO的表達量呈先上升后下降趨勢，基因MiCHI持續高表達，MiPR1在接種72 h時出現最高表達量。

3 討 論

尋找抗病相關基因對于了解病原菌與寄主之間的相互作用機制有重要意義，有助于病害的有效管理。為抵御各種病原微生物的侵入，寄主植物自身有發達的防御機制，包括利用物理屏障，限制病原體的傳播和產生抗菌化合物抑制病原菌的定殖、生長。此外，細胞壁中某些蛋白能識別病原體引起下游防御反應[11]。

中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶果樹病害研究組前期王芳[12]等人研究發現200 μg/mL BTH處理芒果葉片后MiPAL、MiPPO、MiCAT、MiSOD、MiPOD等5種抗病相關基因的酶活性均顯著提高。王媛[8]等研究發現病原菌侵染寄主組織后，寄主組織被侵染部位酶的活性增加，感病后酶活性增加越快，植物的抗病性就強，反之則減弱。

圖6 芒果葉片7個防御相關基因在不同時間的的表達圖譜分析Fig.6 Expression patterns of 7 defense-related genes in mango leaves at different time points

植物的抗病性與POD酶有關，POD酶的高活性是植物抗病的生化機制之一[8]。病原菌侵染后會引起寄主組織中CAT活性下降[13]，而POD和APX的活性會增加[14]。超氧化物歧化酶SOD能夠清除植物體內過多自由基，減輕活性氧對寄主細胞及細胞脂膜的損傷和破壞作用；H2O2能夠在細胞間穩定傳輸，高濃度的H2O2可以引起植物病變部位的過敏性反應直接殺死入侵病原菌，啟動膜脂過氧化，引起細胞死亡，在抗病中起作用[15]。

4 結 論

Lasiodiplodiatheobromae分生孢子侵染芒果嫩葉和成熟果實，能夠不同程度地誘導MiPOD、MiPPO、MiCHI、MiPR1等7個防御酶基因的表達，激發寄主植物對病原菌的抵抗能力，起到延緩病原菌在寄主組織內的迅速擴展的作用。