中國孢囊線蟲新記錄種——野生豆孢囊線蟲記述及其對豆科植物的寄生性測定

甄浩洋，彭煥，孔令安，洪豹元，朱桂蘭，汪銳輝，彭德良，文艷華

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中國孢囊線蟲新記錄種——野生豆孢囊線蟲記述及其對豆科植物的寄生性測定

甄浩洋1，彭煥2，孔令安2，洪豹元3，朱桂蘭3，汪銳輝3，彭德良2，文艷華1

（1華南農業大學農學院，廣州 510642；2中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3江西省婺源縣植保植檢站，江西婺源 333200）

【目的】在江西婺源縣孢囊線蟲調查中，從大豆根及根際土壤中采集到一個孢囊線蟲群體，其形態特征和分子特征與大豆孢囊線蟲（）存在較大差異，因此對其形態學和分子特征以及寄生性等進行詳細研究，以明確其種類及對豆科作物寄生性，為病害防控提供科學依據。【方法】從婺源縣采集的大豆根及根際土樣，用篩淘法分離孢囊，大豆根系上的孢囊用直接解剖法獲取。用淺盤法分離根際土樣中的2齡幼蟲和雄蟲。選取具典型特征的飽滿孢囊制作陰門錐切片，淺盤法分離的2齡幼蟲和雄蟲制作永久玻片，在顯微鏡下觀察記錄孢囊、2齡幼蟲和雄蟲的形態特征，并進行形態特征測量。采用兩對植物線蟲通用引物AB28和TW81以及D2A和D3B分別擴增內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS)和28S大亞基D2-D3區段，經序列測定，用MEGA軟件采用鄰接法（neighbor-joining(NJ)method）構建該線蟲群體與孢囊線蟲屬其他種群的ITS和LUS D2-D3系統進化樹，分析其系統發育關系。在溫室內采用盆栽人工接種的方法，測定江西孢囊線蟲群體對11種豆科作物的寄生性，同時測定國內40個大豆栽培品種對該孢囊線蟲的抗病性。【結果】形態學觀察和特征值測量結果表明，從江西婺源大豆上采集的孢囊線蟲群體，其孢囊形態、2齡幼蟲以及雄蟲的形態特征與野生豆孢囊線蟲（）的形態特征基本一致；ITS序列（MG859982）比對發現其與野生豆孢囊線蟲ITS序列（KU160510和KU160512）的同源性為99%和98%，而與大豆孢囊線蟲ITS的同源性僅為81% (KY794762.1）。D2-D3序列（MG859981）與野生豆孢囊線蟲（KU160511）相似度最高，為99%。序列系統進化樹分析發現以ITS序列與D2-D3序列構建系統發育樹的結果相一致，江西孢囊線蟲群體與野生豆孢囊線蟲分布在同一支，節點支持率為100%，而與大豆孢囊線蟲聚在另一個分支中。結合形態學和分子生物學結果，將江西婺源大豆上的孢囊線蟲群體鑒定為野生豆孢囊線蟲，系中國新記錄種。寄生性研究結果表明，在參鑒的11種豆科作物中，野生豆孢囊線蟲的2齡幼蟲能在大豆和相思豆（紅豆）上侵染和繁殖，完成生活史；雖然能侵染豇豆、豌豆、扁豆、綠豆、赤豆、刀豆、菜豆和苜蓿8種作物根系，但不能完成生活史。測定的40個大豆栽培品種中，19個高感、11個中感、5個中抗、5個高抗。【結論】在我國江西婺源新發現的一種寄生于大豆的孢囊線蟲為野生豆孢囊線蟲, 系中國新記錄種；人工接種條件下相思豆（紅豆）也是野生豆孢囊線蟲的寄主，40個大豆栽培品種中30個對該孢囊線蟲表現感病。

野生豆孢囊線蟲；中國新記錄種；形態學；分子鑒定；寄生性

0 引言

【研究意義】大豆（）是世界上最重要的作物之一，在我國有悠久的種植歷史，是我國重要的油料作物。全球大豆種植面積1.02億公頃，年產量2.54億噸[1]。影響大豆生產的病害很多，而大豆孢囊線蟲病是制約我國大豆生產的主要病害之一。大豆孢囊線蟲病在我國東北、華北及黃淮海等大豆主產區廣泛分布，一般造成大豆減產5%—10%，嚴重地塊減產30%—50%，甚至絕收[2]，其致病的病原線蟲主要為大豆孢囊線蟲（）。2015年7月至2016年7月，作者從江西婺源大豆根際土樣中及根系上發現一個孢囊線蟲群體，其形態特征和大豆孢囊線蟲存在較大差異，明確該孢囊線蟲群體的種類及其對豆科植物寄生性，對病害防控具有重要意義。【前人研究進展】孢囊線蟲系一類定居性的植物內寄生線蟲，很多具經濟重要性的種類都屬于孢囊線蟲屬（）。目前國內外報道的孢囊線蟲屬描述的種類有80多個，其中在全球范圍內給農業生產造成嚴重損失的有大豆孢囊線蟲甜菜孢囊線蟲（）、禾谷孢囊線蟲（）等[3-5]。在我國，引起農作物病害的重要孢囊線蟲種類主要有大豆孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲（）[6-8]等。近年來國內報道的孢囊屬新種有中華孢囊線蟲（）[9]、馮氏孢囊線蟲（）[10]、海南孢囊線蟲（）[11]和廣東孢囊線蟲[12]（）等；描述的新記錄種有旱稻孢囊線蟲（）[13]、朝鮮孢囊線蟲（）[14-15]等。2016年，kang等[16]描述了一種寄生于大豆的孢囊線蟲新種——野生豆孢囊線蟲（），該孢囊線蟲目前僅在韓國被報道，對于該孢囊的致病性和寄主范圍也還未見相關研究報道。【本研究切入點】2015—2016年，在對江西省主要農作物孢囊線蟲病害調查中，于上饒市婺源縣大豆根際土樣及根系上發現一個孢囊線蟲群體，該孢囊線蟲的形態特征與大豆孢囊線蟲有較大差異，有必要明確其種類、寄主范圍及致病性等。【擬解決的關鍵問題】結合形態學和分子生物學方法對采集自江西婺源大豆上的孢囊線蟲群體進行鑒定，明確其寄主范圍及致病性特點，為今后進一步的研究和防控打下基礎。

1 材料與方法

1.1 孢囊線蟲的采集、分離與擴繁

大豆根系及根際土壤于2015年7月至2016年7月采自江西省上饒市婺源縣萬嶺村。將帶回的大豆根系洗凈后在解剖鏡下觀察，直接解剖法獲取根系上的孢囊，土樣采用淘洗過篩法分離土樣中的孢囊[5]。采用淺盤法分離土壤中的2齡幼蟲（J2）和雄蟲。

在盛滿滅菌沙土（土壤﹕沙=3﹕1）的塑料缽（直徑12 cm、高15 cm）中種植和樣品采集地所種植的相同大豆品種（婺源羅漢豆），每盆定苗一株，待大豆長至一片真葉時參照Kong等的方法[17]，配制和接種孢囊卵懸浮液，用1 ml的槍頭在大豆苗的周圍均勻插3個小孔，將卵懸浮液分別從小孔注入后，覆好滅菌土。接種后5 d內不大量澆水，置于25—28℃溫室條件下培養。

1.2 形態學觀察及測量

選擇收集飽滿的孢囊，參照馮志新[18]的方法制作陰門錐切片。參照謝輝[19]的方法挑取J2和雄蟲制作玻片。65℃水浴加熱殺死線蟲，用FAA（福爾馬林-冰醋酸-乙醇固定液）固定，制作成臨時玻片，在Leica光學顯微鏡（DM2500）下觀察、拍照、測量。形態學觀察特征及測量值包括J2的體長、最大體寬、口針長、食道長、背食道腺開口到口針基球的距離、尾長及透明尾長；孢囊的形態、孢囊下橋的有無、膜孔及類型、泡狀囊泡的有無及陰門裂長度等[5]。

1.3 分子生物學鑒定

1.3.1 DNA提取 參考亓曉莉等[20]的方法，挑取田間采集和溫室單孢囊擴繁群體中大豆根際土樣及根系上的單孢囊，置于含有10 μL雙蒸水、3 μL的蛋白酶K（600 mg·ml-1，Roche，德國）和7 μLPCR-buffer緩沖液（含mg2+）（Takara，大連）的離心管中，在液氮中速凍1 min后用滅菌玻璃棒研磨，待冰完全融化后，重復在液氮中速度研磨3次后，置于-80℃條件下至少保存2 h，將離心管轉入PCR儀中，進行DNA提取，反應過程如下：65℃下溫育90 min，85℃條件下保存10 min，最后4℃保存。DNA提取的產物在12 000 r/min離心1 min，取上清DNA懸浮液于-20℃中保存備用。

1.3.2 序列擴增 以上述單孢囊DNA為模板，參考Cui等[21]的方法，以引物D2A（5′-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG-3′）和D3B（5′-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3′）擴增核糖體DNA 28S D2-D3區域，以引物AB28（5′-ATA TGC TTA AGT TCA GCG GT-3′）和TW81（5′-GTT TCC GTA GGT GAA CCT GC-3′）[22]PCR擴增內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS），PCR擴增體系：模板DNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix buffer（Takara,大連）12.5 μL，10 μmol·L-1的引物各0.5 μL，無菌雙蒸水補充至25 μL。擴增條件為94℃預變性，5 min，94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環，72℃終延伸10 min，4℃保存。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠分離后，觀察照相。擴增產物采用瓊脂糖凝膠純化試劑盒（北京天根生物科技公司）純化；純化產物連接到pEASY-T1 Simple載體上（北京全式金生物技術有限公司），熱激轉化大腸桿菌感受態細胞，經過PCR擴增鑒定得到的陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 序列分析及系統進化樹構建 測序結果采用DNAman和DNAstar 7.01進行去載體和序列拼接后，在NCBI網站進行blastn比對。同時從GenBank下載孢囊線蟲其他近緣種的ITS序列和D2-D3區序列，用MEGA 5.0軟件，鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建該線蟲與其他孢囊線蟲屬ITS序列和D2-D3區序列系統進化樹[23-24]。

1.4 寄主范圍測定

11種豆科作物21個品種（種子購自興農種業公司）分別播種到PVC管（直徑5 cm、高25 cm）中，播種和人工接種方法如1.1所述，接種量為每株接種1 ml1 200粒/ml的卵懸浮液，每個處理4次重復，設感病大豆（婺源羅漢豆）為對照，溫室條件下常規栽培管理。在接種后7 d參照Bybd等[25]的方法取其中兩株進行根系品紅染色，顯微鏡下觀察線蟲侵染情況。在接種后60 d取剩余兩株，采用過篩法收集根系和土壤中孢囊于濾紙上統計孢囊數量，計算每個品種剩余兩株的平均孢囊數。

1.5 抗病性測定

同1.4中的方法種植40個大豆栽培品種（來自黑龍江、遼寧、河北、河南、江西等省份）并參照1.1接種野生豆孢囊線蟲卵粒，每株接種1 ml1 200粒/ml的卵懸浮液，每個品種設置4次重復，設置感病品種（婺源羅漢豆）為對照，在日光溫室25—28℃條件下常規栽培管理。在接種后第60天取PVC管采用過篩法收集根系和土壤中孢囊于濾紙上統計孢囊數量，計算每個品種各重復的平均孢囊數和孢囊指數（公式1）并對其進行抗性評價。

孢囊指數=（供試品種的平均孢囊量/感病對照品種的平均孢囊量）×100% （1）

按 Schmitt等[26]提出的鑒定大豆抗病性的IP標準進行分級：高抗0—9%（VR），中抗 10%—30%（MR），中感31%—60%（MS），高感＞60%（VS）。

2 結果

2.1 形態學觀察與測量值

顯微鏡下對孢囊、2齡幼蟲（J2）和雄蟲的形態學進行觀察和測量，形態學測量和文獻記述比較見表1。中國江西大豆根上孢囊線蟲群體的描述如下。

表1 野生豆孢囊線蟲中國江西群體形態特征測量值

孢囊：蟲體檸檬形或近圓形，與大豆孢囊線蟲相比更圓，陰門錐突出較不明顯；雌蟲顏色白色，成熟以后孢囊呈深褐色或亮黑色，有明顯的頸（圖1-C、1-D）；陰門區雙半膜孔，無下橋和囊泡，極少存在卵囊團（圖2）。J2：殺死固定時，蟲體向腹部微彎，呈線形（圖3-F）；口針粗壯，口針基部球卵圓形，頭部縊縮不明顯，頭架明顯（圖3-D）；側區4條側線；尾圓錐形，尾端尖，透明尾長占尾長的53%—66%（圖3-E、3-F）。雄蟲：殺死固定時，蟲體向腹部彎曲，輕微的呈弓形（圖3-C）口針粗壯，口針基部球卵圓形，食道腺發育良好，有發達的橢圓形中食道球（圖3-A）。交合刺明顯，彎曲呈弓形。尾部很短，末端呈圓形（圖3-B）。

A：根系上的孢囊Cyst on the roots；B：根系上的白雌蟲Female on the roots；C、D：孢囊Cyst

圖2 孢囊陰門錐特征

A：雄蟲體前端Anterior body portion of male；B：雄蟲尾部Tail of male；C：雄蟲Entire of male；D：2齡幼蟲體前部Anterior body portion of J2；E：2齡幼蟲尾部Tail of J2；F：2齡幼蟲Entire of J2

2.2 分子生物學鑒定

測序結果表明，孢囊線蟲婺源群體的ITS的擴增片段長度為1 033 bp（GenBank登錄號MG859982），28S D2-D3區片段長度755 bp（MG859981），Blast分析結果表明，該群體的ITS序列與GenBank收錄野生豆孢囊線蟲韓國群體的ITS序列（KU160510和KU160512）相似度分別為99%和98%，其次為麥類孢囊線蟲（）（HM560790），相似度為83%，與大豆孢囊線蟲（ KY794762.1）相似度只有81%。擴增得到D2-D3序列與野生豆孢囊線蟲韓國群體的（KU160511）相似度最高為99%，與旱稻孢囊線蟲（）（HM560842），相似度為95%，與大豆孢囊線蟲（LC208677）相似度為91%。從田間采集樣本和溫室擴繁的樣本中獲得的孢囊線蟲相應序列完全一致，無任何單堿基差異。

基于ITS序列和28S D2-D3序列構建的系統進化樹分析結果表明（圖4、圖5），以ITS序列和D2-D3序列構建的發育樹結果相一致，采集自江西大豆上的孢囊群體與來自韓國的野生豆孢囊線蟲聚在同一支，置信度為100%，與旱稻孢囊線蟲、廣東孢囊線蟲等莎草孢囊線蟲群組（）[27]聚在一個大的分支中，而大豆孢囊線蟲與甜菜孢囊線蟲、三葉草孢囊線蟲（）等甜菜群組（）[28]聚在另外一個分支。

2.3 寄主范圍測定

11種豆科作物21個品種在人工接種野生豆孢囊線蟲后7 d，經染色觀察發現J2能夠侵染大豆、相思豆、豇豆、豌豆、扁豆、綠豆、赤小豆、刀豆、四季豆和苜蓿10種豆科作物，但是只有在大豆和相思豆（紅豆）的根系上能夠發現豆莢形的3齡幼蟲（J3），而在其他豆科作物上發現J2的侵染點都產生了較為嚴重的褐變（圖6）。在接種后60 d經過檢測，僅在大豆和相思豆（紅豆）上能夠產生孢囊，完成生活史（表2）。

圖4 利用鄰接法構建的江西孢囊線蟲種群與其他孢囊線蟲種的ITS序列系統進化樹

圖5 利用鄰接法構建的江西孢囊線蟲種群與其他孢囊線蟲種的LUS D2-D3序列系統進化樹

2.4 抗病性測定

40份大豆栽培品種中對野生豆孢囊線蟲表現高抗的品種有5個，中抗的品種有5個，中感品種有11個，高感品種有19個。結果表明參鑒品種中75%的大豆栽培品種對來自江西的野生豆孢囊線蟲表現感病（表3）。

3 討論

形態學觀察和測量結果表明，采集自中國江西大豆根上的孢囊線蟲群體與韓國的野生豆孢囊線蟲[16]形態學特征基本一致。江西群體的孢囊個體較韓國群體孢囊略小（中國江西種群/韓國種群：體長495.0 μm/513.0 μm，體寬448.0 μm/416.0 μm）。江西群體與韓國群體就陰門錐特征相比膜孔較小，中國江西群體/韓國群體：膜孔長33.0 μm/41.0 μm，膜孔寬26.0 μm/37.0 μm）。可能是生態環境、地域差異造成，大豆品種的不同也可能對群體分化存在一定的影響[29]；中國江西群體2齡幼蟲（J2）、雄蟲與韓國群體J2、雄蟲相比形態學特征測量結果較為一致（表1）。孢囊形態觀察韓國群體沒有能夠觀察到卵囊團[16]，而中國江西群體極少但能觀察到卵囊團。形態學鑒定結果認為江西大豆根上孢囊線蟲群體與韓國野生豆孢囊線蟲一致，而與大豆孢囊線蟲相比有較大差別，野生豆孢囊線蟲的孢囊形態更圓，表皮有光澤，無下橋和囊泡。

a：大豆Glycine max；b：相思豆Abrus precatorius；c：豇豆Vigna unguiculata；d：豌豆Pisum sativum；e：扁豆Lablab purpureus；f：綠豆Vigna radiata；g：赤豆Vigna angularis；h：刀豆Canavalia gladiata；i：菜豆Phaseolus vulgaris；j：苜蓿Medicago sativa

表2 野生豆孢囊線蟲江西群體對豆科作物的寄主范圍測定

表3 大豆栽培品種對野生豆孢囊線蟲江西種群抗性鑒定

野生豆孢囊線蟲于2016年由Kang等[16]在韓國大豆上發現并首次報道，目前還未在其他國家和地區被發現報道，也未見關于其致病性與寄生性方面的報道。在研究野生豆孢囊線蟲對豆科作物寄主范圍測定中，通過根系染色觀察到在J2侵染時期，在非寄主或不良寄主的根系內J2侵染點附近會產生較為嚴重的褐化現象（圖6），可能是因為線蟲侵染導致的免疫反應，使得孢囊線蟲不能建立取食位點，最終造成其不能完成生活史。栽培大豆品種的抗性鑒定結果表明，在參與鑒定的40個大豆栽培品種中感病品種所占比例較高，目前國內多數大豆栽培品種對該孢囊線蟲沒有抗性。國內外的生產實踐表明在大豆孢囊線蟲病的防治中，培育抗病品種是最經濟有效的方法[30]，因此通過篩選對野大豆孢囊線蟲具有抗性的大豆種質資源具有重要意義。

大豆孢囊線蟲病在黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、山西、山東、河南、河北、安徽、江蘇、浙江、廣西和江西等省（自治區）均有不同程度發生[31]。此次報道的野生豆孢囊線蟲系我國寄生于大豆上的孢囊線蟲新記錄種，目前僅在韓國和中國江西被發現。我國其他省份是否有該孢囊線蟲發生分布還有待于進一步調查明確。鑒于韓國和中國江西兩地緯度跨度較大，涵蓋了我國東北、華北和黃淮海等主要的大豆種植區，與大豆孢囊線蟲的主要發生分布區域一致[31]，并且本研究在種群擴繁時，在北京夏天室外盆栽種植大豆接種后該孢囊線蟲也能夠較好的寄生和完成生活史，綜合以上情形推測該孢囊線蟲對于環境有較好的適應性，在我國大豆主產區能夠生存繁殖，因此有必要引起重視。

4 結論

依據形態學和分子生物學特征，將采自中國江西大豆上的孢囊線蟲群體鑒定為野生豆孢囊線蟲，系中國一新記錄種；寄主范圍測定結果表明大豆和相思豆（紅豆）是其適宜寄主；對野生豆孢囊線蟲的抗性鑒定表明，40個國內大豆栽培品種中有19個高感、11個中感、5個中抗、5個高抗。

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（責任編輯 岳梅）

, a new cyst nematode record in China and its parasitism to legume crops

ZHEN HaoYang1,2, PENG Huan2, KONG LingAn2, Hong BaoYuan3, Zhu GuiLan3, Wang RuiHui3, PENG DeLiang2, WEN YanHua1

(1College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642;2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;3Station of Plant Protection and Inspection, Wuyuan 333200, Jiangxi)

【Objective】In a survey for cyst nematodes in Jiangxi Province, China, a cyst nematode population was collected and extracted from soybean roots and rhizosphere soil. The morphological characteristics of this population are different from that of the soybean cyst nematode (). The objective of this study is to research morphological and molecular characteristics and parasitism test of this population, identify their species and parasitism to legume crops, and to provide scientific basis for disease prevention and control.【Method】Soil samples were collected in Wuyuan County, Shangrao City, Jiangxi Province. The cysts were collected by sieving method or dissected from the roots. The 2nd stage juveniles (J2s) and males in soil were extracted by using the shallow disk method. The cysts with typical characteristics were selected to make a slice of the vulva cone, the J2s and males separated by shallow disk method were made into permanent slides. Morphological characteristics of cysts, J2s and males were observed and measured under microscope. For molecular studies, single cyst from soybean roots was picked and then ground to extract the genomic DNA. The ribosomal RNA-ITS region and the D2-D3 expansion segments of 28S large subunit rRNA gene were amplified with universal primers AB28, TW81 and D2A, D3B, respectively. The sequencing results were deposited in the GenBank database and compared with nematode sequences using the BLAST homology search program. The closest sequences were selected for phylogenetic analyses. The MEGA software was used to construct the ITS and LUS D2-D3 phylogenetic tree of cyst nematodes using neighbor-joining method. The parasitism of this cyst nematode to 11 legume crops and 40 soybean cultivars was tested by artificial inoculation in greenhouse. 【Result】Morphological characteristics of cysts, J2s and males of population in this study agreed withreported in Korea. Sequence from the ITS-rDNA (MG859982) was 99% and 98% identical to those offrom Korea (KU160510 and KU160512) and only 81% identical to the soybean cyst nematode () (KY794762.1). The D2-D3 (MG859981) sequence was 99% identical tofrom Korea (KU160511). In addition, analysis of phylogenetic trees constructed by the ITS and LUS D2-D3 both showed that the Jiangxi population andwere grouped in the same clade with a reliability of 100%. The cyst nematode population from Jiangxi was identified asa new record species in China. Inoculation of 11 legume crops showed that J2s ofcould infect 10 crops (soybean, jequirity, cowpea, pea, lentil, mung bean, adzuki bean, sword bean, green beans and alfalfa), but could complete the life cycle only on soybean and jequirity. Soybean cultivars resistant identification test results showed that 19 cultivars of the 40 inoculated soybean cultivars were highly susceptible, 11 cultivars were moderately susceptible, 5 cultivars were moderate resistant and 5 cultivars were highly resistant.【Conclusion】The population of cyst nematode collected on soybean from Jiangxi, China was identified as- a new cyst nematode record in China. Parasitism tests indicated that soybean and jequirity were suitable hosts for, and 30 of the 40 soybean cultivars were susceptible to phenotypic disease of cyst nematodes.

; new record in China; morphology; molecular identification; parasitism

2018-02-28；

2018-04-16

國家公益性行業（農業）科研專項（201503114）

甄浩洋，E-mail：Zhy910801@163.com。通信作者彭德良，E-mail：pengdeliang@caas.cn。通信作者文艷華，E-mail：yhwen@scau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.007