細胞重組的轉化應用

◎ 斯坦福大學干細胞生物學和再生醫學研究所病理學副教授 馬里厄斯.韋尼格

在很久之前,我們知道細胞發展被稱為是單向的，像胚胎大部分的發展要成熟，由胚胎細胞分化為不同類型的細胞，最后在我們成人體內可以看到細胞不斷成熟。但是都認為細胞分化是單向的，但是由于不同的編碼編程以及不同的組合的經驗，可以把一個完全成熟的細胞進行轉化，回到它的原始狀態，這就是我們首先要分享的內容，我們所說的細胞和它的研究。

之前也有克隆的研究，東京大學的教授認為一些轉錄的因素可以幫助我們把細胞轉化為和胚胎干細胞非常類似的細胞。因此我們就在想，這種直線性的發展，我們要考慮到這些細胞之間的關系，或者說我們把一個非常成熟的狀態的細胞，假如說成人細胞如何把它回歸到原始的胚胎細胞的狀態，這是非常精彩的現象。如何把一個成熟的成人細胞轉化成為原始的狀態，如何把纖維元細胞變為神經元細胞？我們認為，誘導神經元細胞是從纖維元細胞中獲得的，直接變為神經元細胞。

設想如何從病人身上找到一些樣本？我們把這些細胞進行重組，從IPS可以把它們直接進行組合，利用這些細胞實現葡萄糖的運輸。帕金森癥的一些患者主動加入了我們的研究，我們希望能夠了解人類的基因工作機理以及基因如何突變的，如何會導致這些老年癡呆癥以及帕金森癥。

我們思考這個問題從何而來？這是一個非常積極的項目。我們希望能夠進一步的思考，找到這種結果。如何能夠實現這種轉換，從一個不同的細胞類型、纖維元細胞轉化為神經元細胞，他們本來沒有什么關系，這個轉錄的因素叫做Ascl1，這是一個非常基本的轉換，從Helix可以找到它的轉錄因素。這些因素一般來說是可以把不同的鏈整合在一起。我們要問的第一個問題是：Ascl1在纖維元細胞組中處在哪個位置，纖維元細胞一旦呈現出來的時候，我們希望找到它的基因組，它的基因阻在哪個部分，基因組中SCRE在哪個地方呢？我們可以看到這個基因組在這里有一個熱圖，我們利用IP序列的方式找到他的熱圖，在MEFs以及BAM方面它的特征跟NPCs是一樣的，也就是說這些基因的目標是非常開放的，是在纖維元細胞當中可以找到的，或者說我們可以找到Ascl1，纖維元細胞里面可以找到相似的細胞組行，這是它的轉錄里面非常相似的類型，就是它的這種染色質是如何整合在一起的。為了把他們區分他們是開放的，讓你可以找到這些基因序列。到底我們怎么樣能夠在這個過程中進行分別，尤其是在表達之前可以進行區分。首先是經過處理，還有再目標的基因分子。看這周圍兩者相聚比較近，這是科學上的表述。也就是說他們的DNA在核附近，做這個附近意味著他們沒有辦法轉錄，是封閉的，這是非常重要的一點。只有一部分的轉錄因子是存在，也知道他們可以實現轉錄，他們被稱之為先鋒因子。所以我們知道Ascl1指的是有相應的靶向先鋒因子的。

在目標方面，可以看出有一些差異的存在，一旦表達了出來，就可以開放性的表達，這個區域對其他轉錄的區域是開放，對于其他染色質的建模都成為了可能性，我們希望通過這種方式更好地了解，并且衡量實際所發生的狀況。為了能夠做到這一點，把我們的方法進行了一定的優化。我們的方法叫做ATAC-seq，把這個染色質開放又關閉，這個開放可以了解整個發展進程的變化。或者是從DNA的階段出現。這里藍色所展示就是我們這個TM-5，其實是我們秩序的指引物，而我們的Chromatin一旦進入核的區域就沒有辦法進行融合了。我們把這個方法應用到一系列的重要的結合點，這個結合點也顯示出染色質動態的變化。在圖中黑色的曲線所代表的區域，如果出現了lttTA是有基本的信號，但是如果說我們在經過了12個小時之后，我們的這個信號就會極大的提升，而且是非常明顯的，而且是開放式的，大家可以在圖中看到這個信號不斷增加，在整個轉錄過程中這個信號是在快速增加的。紅色是不同的效率，離染色質比較近。在這一塊經過五天之后，明顯可以發現這個數值的變化還是比較大的。也就是說，在兩邊有兩個核的區域。這個核的區域正好就在中心的兩邊。因此，一個單一轉錄的區域是如此的漂亮，他們有著直接的靶向區域，從一開始的時候是更加隨機的分配的模型，接著逐漸轉化到了更加高結構化的架構，在這里給大家展示的數據也有類似的觀點。

基于顏色密度不同，可以看到這個顏色之間出現的分辨率的情況，在這里我不想浪費大家的時間沒有辦法講特別細，但是我想讓大家可以看一下，這兩張圖其實是有所不同的。因為在這里有兩朵云，第二朵云這兩邊就更平一些，這就是我們所謂的第二個細胞核的層，而且跟第一層會有著一定的重疊。

剛才給大家展示了都是一些其他的數據，這都是從靶向、目標的角度來思考的。基因學當中可以分析，如果改變基因其他方面會帶來怎樣的影響？對于所有基因科學家來說，因為我們的基因協會是面向開放的，我們就能夠看到有很多的變化已經出現了。最上面的區域密度是比較大，還有一些平均密度比較高的區域正在關閉，而其他的區域卻并非如此。這其實是因為我們激活了它的轉錄因子，我們到底應該怎么樣決定什么時候應該關閉，最重要的是我們可以看一下目前沒有非常明確的機制，我們必須依靠內部的方法和工具，包括一些通用的效果和方法來實現這一點。

我們發現的另外一個驚奇是，做調查的時候可以看到對不同的情況，從0到220，在這個過程中可以看到隨著地點的放開，這些變化不是漸進式的，這里實現的是兩天到五天時間非常性的提升。我們的整個轉錄過程其實也是逐漸所產生的。而且，是需要我們進行緩慢的安排。在此過程中出現了非常快速、明顯的轉化，就像我們在建模一樣的。這些調整是對序列的調整。

第二天和第五天的時候，是在逐漸的成熟化的轉換過程中。比如說在第二天的時間軸，在我們通過控制、對照的過程來進行一些區分，到第五天產生了更加巨大的變化。從細胞生物學的角度來看，大部分的變化都是后期產生的，都是需要有相應的設計，我們在一開始的時候不需要期待有太多的變化，但是實際上在最后我們的變化是逐漸累計而成的。很遺憾沒有特別多的時間給大家介紹另外一個轉錄的流程，這個轉錄的流程就只能給大家稍微做一些簡要介紹了。

我想跟大家介紹一下我們當前所做的工作和研究。這個研究我們把它叫做Myt1l。通過我們神經元的流程有一個過程，這個過程是對非神經元程序的抑制，我們發現它們通過配合能夠形成更好的效果，它們可以更加有效地開發并且關閉神經元的程序，也有相應神經元負責不同的基因。比如說對部分神經元的編輯。跟大家強調一下，我們當前所看到的一些主要結論：

IPS細胞是如何運作的？大家比較熟悉，有各種不同的類型。為了強調它們之間的差別，我想跟大家談一下最近所發布的一些資料當中設計出來的信息，可以看到這兩者之間的機理是有多大的差異。這里主要是有四類不同的程序，從左往右，首先是MES，第二個是經過48小時，第三是經過預先的處理的方式，最后是ESC的方式。給大家展示的是，如果EVs增加，那么這個增加就要求我們進行一些更加詳細的分析，有沒有出現一些特定的表達，如果說它確實快速地關閉了我們所需要的類型，而且這個程序本身是需要能夠得到表達的。

接下來考慮整個刺激的變化，確實會有一些變化的發生，有一些是技術上很好的，可以測量和評估的，包括對于阻蛋白調節的變化，這些變化需要很長的時間累計，才能產生明顯的效果。

轉錄因子去哪里了？我們有一些提升的因素，這些因素當然受了一些主要的推動因素的影響，比如說βB，這一塊我們可以看到這個轉錄因子失去了它兼容性，沒有辦法更加明顯地表現出來。如果說我們現在去問到底影響整個的編碼因素是什么？我們通過觀察發現，這些再次編輯作用不是在初期所出現的，而是有不同的變化呈現，是有結合的，最后得出來的結論是即使說它可以引起轉錄因子的變化，正是這樣的因素關閉了刺激的因素。這就花了非常長的時間，專門用相當的精力進一步探索到底是由哪些因素起到的作用。我們的這種轉錄因素可以找到合適的目標，而且在這樣的纖維元細胞里面可以明確想要找到具體的基因序列是哪個。

我想進一步地闡述這種機理的原理。我們可以看到這種基因的序列的研究。可以帶來非常有趣的觀察，調整出其中一個比較有趣的結論跟大家分享一下。

這里有100-120個左右的細胞，從纖維元細胞到神經元細胞，基于它的基因表達相似之處，發現這個基因里面有這個曲線，這就是一個重組的路徑，另外兩個比較有趣的現象發生在這個重組路徑中，這些細胞他們之前所說誘導神經元細胞到神經元細胞的過程，跟原始路徑是截然不一樣的，而且也是呈現出一種向下的曲線。這個五個細胞不能從下降的曲線、下降的轉錄因素里面找到。這里我們所說的Ascl1，這幾個細胞形成一個大的群體，很多細胞通過誘導產生，可以用于我們的分析。因此，Ascl1這些細胞他們可以產生出非常密集的趨勢，這些細胞可以非常有選擇性的進行表達，而且它們呈現出比較統一的表達類型。為了增強這一點我們也是在這個區域來分析纖維元細胞和神經元的對比。可以發現這些細胞是在原始項目里面誘導出來，某種情況下它們的細胞越來越多，Ascl1是一個比較啟動的因子，可以讓我們了解這樣一個基因序列的作用，可以作為一種轉錄的啟動因素，因此我們就會思考Ascl1是否有一些深入化學的特性和肌肉有關、和神經元有關，在我們的研究過程中在我們的項目里面其實沒有發現這些具體的信息，對于這樣一個體我們需要進行不同研究。思考一下MyoD和Ascl1的特點，在神經細胞里面把MyoD放到其中，他們有相似的地方。Ascl1可以誘導神經元細胞，MyoD1可以誘導肌肉細胞，這張圖中可以顯示出結果。另外，在這個項目里面還可以發現這些Ascl1有關的序列是被激活的，我們把這樣的兩個轉錄因素進行具體的描述，在纖維元細胞中如何進行爭取的。我們來研究Ascl1和MyoD這些轉錄因素的相似之處。在這些項目中它們有相同的整合方式，盡管說這種整合方式比較相似，這個轉錄根本上來說是截然不一樣的。因為它的功能性是相反的，從神經元到纖維元細胞到肌肉細胞有不同的過程。

它們這種轉錄功能是不一樣的通過一定的數據分析之后，我們需要看一下它的這種整合類型的數量，從數量方面進行考量。通常我們把這些數據進行分層、進行分類，并分析它們結合的強度。Ascl1有很強的整合效果，而從數量角度來看MyoD的整合方式是比較強的。另外，還有一種方式來評估它的基因序列，可以看出Ascl1以及MyoD基因表達的相關性。這可以幫助我們解開問題的答案。像我們之前所說的，Ascl1是和神經元細胞以及肌肉細胞有關，從MyoD的角度進行考量。我們可以看一下它的這種肌肉細胞和神經元細胞的關系，它的表達性可能說不像MyoD表達性那么強，那么因此如何實現一種平衡，能夠把MyoD和Ascl1之間的基因表達進行平衡，能夠把這些神經元進行啟動。有一種抑制劑，可以抑制這種肌肉細胞，如果把MyoD和Ascl1進行抑制的話形成這樣一個結果，MyoD有一個非常強的肌肉細胞表達。